PARED CELULAR DE Neisseria

Presentación del tema: "PARED CELULAR DE Neisseria"— Transcripción de la presentación:

1 PARED CELULAR DE Neisseria
Juan Diego Mónoga Cáceres Jose Alfredo Pallares Garnica Nayla Fernanda Peña Bareño Karen Natalia Villamizar Ojeda 19 de Enero del 2016

2 GENERALIDADES Gramnegativos forma de cocos.
Diplococos tienen caras adyacentes aplanadas, que les dan una apariencia de “grano de café”. Todas las especies son oxidasa-positivas y casi todas sintetizan catalasa. Habitan en la superficie de las mucosas de huéspedes de sangre caliente. Aerobios, inmóviles, no formadores de endosporas, capnófilos. Temperatura optima de 35 °C a 37 °C. Se desarrollan mejor en ambientes húmedos. Producen ácido a partir de hidratos de carbono en forma oxidativa. GENERALIDADES

3 ESPECIES N. gonorrhoeae N. meningitidis
N. subflava (que incluye las biovariedades subflava, flava y perflava) N. lactamica N. sicca N. mucosa N. flavescens N. cinérea N. polysaccharea Subespecies: N. elongata “N. kochii” Tomado de: Microbiología clínica Murray, Página 312

4 ENFERMEDADES La enfermedad meningocócica es una enfermedad contagiosa ocasionada por la bacteria Gram-negativa Neisseria meningitidis o meningococo. La infección ocurre en formas endémicas y epidémicas, tanto en países en desarrollo como en países desarrollados. La transmisión de N. meningitidis se realiza por contacto de persona a persona, o por la inhalación de gotas respiratorias que contienen meningococos. Las cepas de Neisseria gonorrhoeae, también conocida comúnmente como “gonococo” o “GC”, causan unos 62 millones de casos de gonorrea al año en todo el mundo. Trasmitidas por contacto sexual, las cepas de N. gonorrhoeae pueden infectar las superficies mucosas urogenitales (cuello del útero, uretra, recto) y la oro y nasofaringe (garganta), causando infecciones sintomáticas o asintomáticas. El gonococo es siempre patógeno.

5 FACTORES DE VIRULENCIA
Neisseria gonorrhoeae Lipooligosacaridos Fimbrias (pili) Proteinas de la membrana externa Porl-PorA/PorB Proteinas Opa (Proteina II, PII) Proteina Rmp (Proteina UI, P.III) Proteina H.8 IgA l Proteasa Plásmidos Neisseria meningitidis Polisacaridos capsulares Proteinas de la membrana externa PorA y PorB Proteinas Opa y Opc Proteinas de adquisicion/ union al hierro FACTORES DE VIRULENCIA

6 N. gonorrhoeae Componentes que contribuyen a patogenicidad y resistencia a los antibióticos.

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9 Phase Variation of PorA, a Major Outer Membrane Protein, Mediates Escape of Bactericidal Antibodies by Neisseria meningitidis Isfahan Tauseef, a * Youssif M. Ali, b,c Christopher D. Baylissa April, 2013

10 Portadores asintomáticos
Puede durar de 6 a 9 meses Asociado con la inducción de respuestas inmunes protectoras Cepa específica Principales blancos de estas respuestas inmunes Proteína PorA Proteínas de membrana externa más altamente expresados de meningococos.

11 Proteína transmembrana con siete bucles externos en su membrana.
PorA Dos de estos bucles exhiben altos niveles de variación antigénica. Se utilizan para la caracterización de cepas. Bucles VR1-VR2 Candidata a vacuna clave, a pesar de generar una única protección contra una cepa específica. Bexsero, es una vacuna que contiene esta proteína y está a punto de tener licencia para funcionar.

12 Objetivo principal del artículo
Demostrar que el escape de la muerte Anticuerpo monoclonal bactericida dirigido a la proteína PorA Mediada por alteraciones en el tramo de repetición Cambios graduales en el nivel de expresión superficial de esta proteína.

13 MATERIALES Y MÉTODOS

14 CEPAS Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO BACTERIANO.
BHI N. Meningitidis MutS Células meningococias Exámenes expresión proteínas Agar chocolate BHI en Fase semi-log ANÁLISIS FENOTÍPICOS Y GENOTÍPICOS DE VARIANTES PORA Ensayo bactericida Inmunotransferencia Mab primario FALLÓ PCR Primers PorA p21 PorA p72 25 ciclos

15 PRUEBA DE BACTERICIDA EN SUERO MODIFICADO
Cultivo meningococo (agar chocolate) Re suspendido en PBS En caldo ELISA Evaluar conteo bacterias Diluciones seriadas Mezcla: Suero + MAb 2 Horas , 37 °C , CO2 5% ANÁLISIS DE LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE LA PROTEINA A Crecimiento en BHI Western Blot ELISA (con células resuspendidas PBS) Espectrofotómetro Citometría de flujo

16 RESULTADOS

17 Detección de escape inmune por meningococos.
Variación de Fase de PorA media el escape de Neisseria (cepa 8047) de la actividad bactericida de un anticuerpo monoclonal PorA-específico. Ensayo bactericida Suero modificado Detección de escape inmune por meningococos.

18 Porción grande de inóculo Células meningocócicas Pasajes secuenciales
Ensayo Porción grande de inóculo Células meningocócicas Pasajes secuenciales Anticuerpo bactericida y suero humano Fuente activa de complemento

19 Células sobrevivientes Variantes de escape
Prueba que hay alteraciones en genes relevantes El ensayo Demuestra que la VF se debe a un tramo de repetición en el marco de lectura del gen lgtG. Mab B5 Anticuerpo bactericida específico para un epítope de Lipopolisacárido.

20 ¿Por qué la PorA? Sujeto a la variación de fase
Repetición del tracto poli-G presente dentro del promotor Alteraciones en los niveles de expresión de la proteína No es un simple interruptor ON / OFF

21 Poblaciones inóculo de tres tamaños diferentes se sometieron a múltiples ciclos de incubación en presencia de 5% de suero humano como fuente de complemento y 10 𝜇𝑙 de una disolución 1:4 de la Solución de stock de anticuerpo monoclonal. Se detectó una reducción de la relación de hasta 47 veces al inóculo en las poblaciones incubadas con anticuerpos, indicativos de matar por el anticuerpo monoclonal. En ausencia de anticuerpo, no se observó reducción, lo que demuestra que el suero humano no contenía ninguna actividad bactericida para esta cepa meningocócica. ¿Qué se observó?

22 El tamaño de la población y la concentración de anticuerpos tienen un impacto importante en el escape inmune. Pruebas UFC UFC 5.000 UFC Éxito En poblaciones intermedias de inóculo. ¿Por qué? Debido a la acumulación de variantes 10G.

23 Una tasa de variación de fase más alta aumenta el escape de los anticuerpos monoclonales.
Baja variación de Fase Ausencia de variantes de escape Repetición de tractos 9G Análisis del escape de Mab por un mutante de la cepa estudio Investigar influencia en la tasa de variación de fase y aumentar el potencial de producción de variantes de fase 9G Mutante mutS con variación de fase 1000 veces superior a la cepa de tipo salvaje

24 Presencia de alto nivel de variantes 10G y 9G
Mutante mutS Mayor tasa de fuga Población inóculo. Presencia de alto nivel de variantes 10G y 9G

25 Análisis de inmmunoblot
Las variantes de escape exhiben un nivel intermedio o bajo de expresión PorA. Escape Mediado por variantes 10G Análisis de inmmunoblot Exhibió un alto nivel de reactividad con el anticuerpo monoclonal, o por variantes 9G no reactivas. No había claridad El escape concreto por variantes 10G. Examinaron Niveles de expresión de la proteína PorA en una variante 11G parental y en variantes 10G y 9G durante los experimentos de selección.

26 Población 5𝑥10 4 ufc Población 5𝑥10 6 ufc Población 5𝑥10 3 ufc sin MAb Población 5𝑥10 5 ufc Población 5𝑥10 3 ufc

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28 Relación 9:1 Relación 1:1 Relación 1:1 Sin MAb

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31 DISCUSIONES

32 Eventos de variación de fase
Facilitan el escape inmune pero hay pruebas limitadas para apoyar su confirmación. Algunos eventos de variación de fase generan estados ON/OFF de expresión para estructuras en particular mientras que otros modulan el nivel de expresión. La conmutación ON a OFF de un epítope de LPS meningococo Demustra mediar la fuga de un anticuerpo monoclonal bactericida específico (anticuerpo monoclonal MAb).

33 Variables de alteración de fase en los niveles de expresión superficial de PorA
Puede mediar el escape de un anticuerpo monoclonal bactericida y especular sobre la importancia de este fenómeno para la persistencia de meningococos en el huésped.

34 Examinó Papel de las variaciones de fase en la mediación del escape frente a un anticuerpo utilizando un suero modificado. Este ensayo Utiliza un gran inóculo e incubaciones en serie, de manera que se presentan variantes en una población. Con el fin de evitar el agotamiento de los anticuerpos bactericidas o la fuente de complemento. Imita la supervivencia de una población bacteriana sobre una superficie mucosa sujeta a la exposición continua y prolongada de una respuesta inmune del huésped.

35 El escape Debido a variantes de fase con un tracto de repetición 10G y una reducción de dos veces en la expresión superficial de la proteína PorA. Detectado por inmunofluorescencia. 5×10 4 Población mínima requerida para que el escape ocurriera con esta cepa.

36 Otros casos El escape inmune debido a un menor nivel de expresión en la superficie se ha detectado con otros antígenos meningococicos. La proteína fHBP es un antígeno importante y se sabe que presentan variaciones de cepa a cepa en la expresión Las cepas con baja expresión de la proteína fHBP exigen resistencia a anticuerpos bactericidas dirigidos contra esta proteína. Debido en parte a los diferentes niveles de un activador transcripcional.

37 Los resultados sugieren
Efecto sinérgico Usando combinaciones de antisueros específicos para antígenos expresados en un nivel bajo. Muerte meningocócica Los resultados sugieren Se requiere un nivel especifico de expresión en la superficie para que ocurra muerte mediada por el complemento de meningococo Hallazgos La variación de fase de PorA permite a los meningococos escapar de la destrucción por los anticuerpos bactericidas debido a una reducción en la concentración de un anticuerpo unido a la superficie y por lo tanto reduce la activación del complemento. El escape debido a las variantes de fase con un tracto de repetición 9G y una reducción de 13 veces en la expresión de PorA se detectó fácilmente con mutantes mutS pero no con una cepa de tipo salvaje.

38 Menos suceptibles a la actividad bactericida
Aspecto crítico Variantes 10G Menos suceptibles a la actividad bactericida Mediada por el anticuerpo monoclonal La detección de la sustitución de 10G a 9G Requeriría más pasajes y mayor concentración de anticuerpos

39 Papel de la proteína PorA en la enfermedad meningocócica no está claro.
Cepas meningocócicas que carecen de una proteína PorA de vez en cuando se han aislado de casos de la enfermedad. La proteína PorA no es esencial para la enfermedad meningocócica. Han habido pocos estudios sobre el estado de variación de fase de PorA en los aislados de enfermedad o después de la vacunación con vacunas que contienen PorA.

40 Reducción en la expresión de PorA podría mediar la evasión inmune.
Van der Ende observo variación de fase de PorA en un nivel de expresión menor entre la garganta y aislamiento invasivos en solo uno de once pacientes. Los aislados de al menos cuatro de estos pacientes mostraron un alto nivel de expresión de la proteína PorA. Alcalá examino 47 cepas clínicas PorA no tipificables y se encontraron dos con alteraciones en un tracto A en el marco de lectura y uno con un tracto 9G en el promotor. Solo encontraron 156 aislamientos (sin serotipo) de los cuales solo cuatro tenían alteraciones en el tracto de repetición de la proteína PorA homologa. Devoy examino 2358 cepas del grupo B de la epidemia en Nueva Zelanda causada por una cepa ST41/44 con una proteína PorA. Una de estas variantes de fase 9G posteriormente demostró ser resistente a los efectos bactericidas de los sueros de los individuos vacunados con una proteína PorA homologa Gorla examino 42 fracasos de vacuna en Brasil y encontró tres con niveles mas bajos de expresión de una proteína porA heterologa debido a la presencia de un tracto 10G.

41 Estos estudios muestran que :
Las variantes con niveles mas bajos de expresión de PorA debido a cambios en el tracto G como se observa aquí pueden ser detectados en los casos clínicos aislados y después de la vacunación. Como no se evaluaron los niveles de anticuerpos antiPorA no esta claro si estos cambios en la expresión se deben a la evasión inmune como lo que se predijo por nuestros resultados in vitro.

42 Estos estudios sugieren
La variación de fase de PorA media el escape inmune la respuesta inducida por la vacuna o por la enfermedad es raro El escape inmune durante la enfermedad puede ser rara porque la enfermedad se cree que ocurre mas frecuentemente poco después de la colonización y antes de que pueda desarrollarse una rta inmune. Es posible que la selección inicial con anticuerpos pueda haber fallado para detectar variantes con pequeñas reducciones en la expresión de PorA Por lo tanto la variación de fase no se denuncia.

43 Aun no esta claro por lo tanto si la variación de fase de PorA en los niveles intermedios (variantes 10G) puede facilitar la enfermedad invasiva o el fracaso de la vacuna al permitir escapar de la respuesta inmune inducida por el huésped. Una determinación mas completa del estado de la expresión del gen PorA en aislamiento invasivos y aislados de población vacunada serán importantes para entender si la variación de fase contribuye a la evasión inmune.

44 Se observa fuga debido a las pequeñas y grandes reducciones en la expresión de esta proteína de superficie. En resumen Los niveles de expresión de una proteína de la membrana externa del meningococo pueden facilitar el escape en respuestas de anticuerpos bactericidas específicos de antígeno.

45 En este informe se demuestra que escape de la muerte por un anticuerpo monoclonal bactericida dirigido a la proteína de poros, está mediada por alteraciones en el tracto de repetición y que estas alteraciones se asocian con cambios graduales en el nivel de expresión de la superficie de esta proteína.

46 MUCHAS GRACIAS