Alta actividad volumétrica

Presentación del tema: "Alta actividad volumétrica"— Transcripción de la presentación:

1 Alta actividad volumétrica
PURIFICACION DE ENZIMAS E2 E2 E3 Reacción a evitar Reacción deseada Alta actividad volumétrica Reacciones indeseables Oxidaciones… Hidrólisis…

2 PURIFICACION DE ENZIMAS A ESCALA LABORATORIO
Adsorción de todas las enzimas (1mg de muestra enzima/ml) Desorción selectiva de nuestra enzima Varios procesos cromatográficos… No importa tiempo ni dinero

3 - SDS – PAGE ELECTROFORESIS Las proteínas se separan por tamaño
+ SDS 100ºC - -galactosidase pura 1 2 3 4 94 67 43 30 20 kDa Las proteínas se separan por tamaño Criterio de pureza: Una única banda

4 PURIFICACION DE ENZIMAS
Muchas proteínas aparentemente similares Intracelulares Pocas proteínas La enzima de interés es mayoritaria Extracelulares Biología molecular

5 PURIFICACION INDUSTRIAL DE ENZIMAS
Métodos sencillos, rápidos y baratos Pocos pasos cromatográficos Columnas cromatograficas pequeñas Adsorción selectiva  100mg/ml columna Conocer mejor los mecanismos de interacción

6 PURIFICACION DE ENZIMAS INDUSTRIALES
Buscar propiedades únicas de nuestra enzima Centro activo Mecanismo catalítico Termo-resistencia Dominios añadidos por Ingeniería Genética Tamaño Características de la superficie (grupos ionizados)

7 PURIFICACION: CENTRO ACTIVO - INHIBIDORES
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD Adsorción muy selectiva de nuestro enzima sobre inhibidores inmovilizados o análogos de substratos Desorción con substratos u otros inhibidores solubles

8 CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
Soportes mal diseñados muchos grupos, muy próximos al soporte Afinidad es casi imposible Otro tipo de adsorciones… Ionicas, endrofobicas…

9 CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
OH Muy pocos grupos Alejados de la superficie del soporte por brazos espaciadores inertes Unión química al soporte  no modifique la interacción enzima soporte

10 EVALUACION DE AFINIDAD ??  ensayo actividad
producto tiempo B+C Adsorción inespecífica producto tiempo B+C Adsorción por afinidad

11 ADSORCION DE Guanidino benzoatasa SOBRE SOPORTES DE AFINIDAD
Influence of immobilized agmatine concentration on the GB adsorption on CH–A. Purified enzyme was incubated with CH–A activated with 0, 2, 8 and 15  mol agmatine/ml gel

12 PURIFICACION DE Guanidino benzoatasa
Purification of GB from ascitic fluid of Ehrlich tumor. SDS–PAGE analysis of the proteins from ascitic fluid of Ehrlich tumor adsorbed on CH–A. Experiments were performed as described in Experimental. Lanes: 1=molecular mass markers; 2=crude preparation of ascitic fluid of Ehrlich tumor; 3=proteins in the supernatant after adsorption on CH–A at 15 mM NaCl; 4=proteins adsorbed on CH–A at 150 mM NaCl; 5=GB desorbed in the presence of enzyme substrate (NPGB).

13 Activación interfacial de lipasas
PURIFICACION DE ENZIMAS Activación interfacial de lipasas Forma abierta Forma cerrada Gota De substrato

14 PURIFICACION DE LIPASAS
Adsorción interfacial sobre soportes hidrofóbicos a baja fuerza iónica Bolsillo hidrofóbico muy grande Pequeños bolsillo hidrofóbicos… Solo se absorben aFI

15 Absorción selectiva de lipasas
CARACTERISTICAS DE ADSORCION INTERFACIAL Absorción selectiva de lipasas Aumento de actividad hacia substratos solubles pequeños Alteración de enantioselectividad Desorcion con detergentes o codisolventes

16 PURIFICACION DE LIPASAS POR ADSORCION SELECTIVA
Mw ( kDa ) 30 45 66 94 20.1 1 5 2 3 4 a b Figure 1 SDS-PAGE. Line 1.- Low molecular weight marks. Line 2.- Commercial preparation of BTL2. Line 3.- BTL2 adsorbed on octyl-agarose. Line 4. octyl-aragose preparation after desorption with 0.2% triton Line 5. Supernatant after the adsorption with 0.2% triton. The protein concentration was 2.5 mg/mL in each case, except in the supernatant that was concentrated around 10 times with centricon. b) Native electrophoresis. Line 1 Crude extract of BTL2. Line 2.- Purified lipase. Experiments were performed as described in the experimental section.

17 PURIFICACION DE ENZIMAS MODIFICADAS POR INGENIERIA GENETICA

18 Cu+2 ENZIMAS CON COLAS DE HISTIDINA His
Modificación muy pequeña (actividad, estabilidad…) Desorcion en presencia de imidazol Formula del imidazol rober…..

19 PURIFICACION DE ENZIMAS CON COLAS DE HISTIDINA
Problema las proteínas nativas también se adsorben a quelatos por unión multipuntual His His Solución: soportes con muy baja densidad de quelatos adsorcion en presencia de concentraciones moderadas de imidazol

20 Effect of the metal chelate
PURIFICACION DE ENZIMAS CON COLAS DE HISTIDINA 100 Effect of the metal chelate on the adsorption of host proteins and poly-His GA

21 100 Adsorption of host proteins and tagged GA on
PURIFICACION DE ENZIMAS CON COLAS DE HISTIDINA 100 Adsorption of host proteins and tagged GA on different IDA-Cu supports in the presence of imidazole 7 mM;

22 Effect of the length of spacer arms on adsorption of NATURAL proteins
PURIFICACION DE ENZIMAS CON COLAS DE HISTIDINA Effect of the length of spacer arms on adsorption of NATURAL proteins

23 PURIFICACION DE ENZIMAS CON COLAS DE HISTIDINA
Over-expression of poly-His GA in E. coli. Proteins were analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and visualized with Coomassie blue. Lanes 1=molecular mass markers; 2=crude extract of E. coli TG1 (pGH6); 3=crude extract of a control culture of E. coli TG1 (pBCKS+); 4=purified poly-His GA following the optimum procedure. Arrows indicate the location of the  - and  -subunits of poly-His GA.

24 Adsorcion iónica multipuntual
PURIFICACION DE ENZIMAS POR INTERCAMBIO IONICO - - - - - - - + + + + Adsorcion iónica multipuntual Desorcion selectiva a concentraciones crecientes de NaCl

25 Regiones “planas” ricas en campos negativos Distintas proteínas
SOPORTES DE INTERCAMBIO CONVENCIONAL - + + - + + - + + - + + + + + Regiones “planas” ricas en campos negativos Distintas proteínas Distinta fuerza iónica

26 + + + Soportes poco activados Adsorcion selectiva de proteínas grandes
- - + - - + - - Soportes poco activados Adsorcion selectiva de proteínas grandes

27 - - - - - - - - - - - - - -

28 ENZIMAS DE TERMOFILOS GRANDES EXPRESADAS EN ORGANISMOS MESOFILOS
Mayor resistencia al calor Absorción selectiva sobre soportes muy poco activados

29 Purificacion de proteinas grandes de termofilo clonadas en emsofilos
Gel filtration analysis of E. coli extracts The crude extract was submitted to 70ºC for 20 min. This sample was injected in a glass column containing 100 ml of 4BCL agarose. Flow rate was 0.5 ml/min. (—) Crude extract before thermal precipitation. () Crude extract after thermal precipitation.

30 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + +
Purificacion de proteinas grandes de termofilo clonadas en mesofilos - - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Conventional supports: Large and small proteins may have adsorption Poorly activated supports: Only large proteins may have adsorption

31 Purificacion de proteinas grandes de termofilo expresadas en mesofilos
b-galactosidase MW (kDa) 94 67 43 31 1 2 3 4 5 6 7 Analysis by SDS-PAGE of proteins adsorbed/desorbed on different aminated supports. Lane 1: Molecular marker, Lane 2: Crude extract of beta-galactosidase from Thermus sp. strain T2. expressed in E. coli. Lane 3: Proteins adsorbed on 1 µmol aminated agarose support, Lane 4: Proteins adsorbed on 2.5 µmol aminated agarose support, Lane 5: Proteins adsorbed on 5 µmol aminated agarose supports, Lane 6: Proteins adsorbed on 10 µmol aminated agarose support, Lane 7: Proteins adsorbed on 40 µmol aminated agarose support. Experiments were performed as described in Methods.