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DESARROLLO DE INÓCULO

2 INÓCULO Ser vivo Medio de cultivo Microorganismos Crecimiento
Propagación Ser vivo Medio de cultivo

3 Inóculo: Cantidad de microorganismos o células capaz de garantizar, las condiciones económicas y de fermentación en un volumen dado el mosto. Volume útil del fermentador = V 0,5 a 50% Volume de inóculo = 0,005.V a 0,5.V El valor, depende del organismo, del tipo de medio, del proceso de que se trate, etc., se debe definir previamente experimentalmente

4 Estado líquido (acuosos u oleosos)
INÓCULO EN LA INDUSTRIA Estado líquido (acuosos u oleosos) Estado sólido Polvo o granular

5 ETAPAS PARA PREPARAR EL INÓCULO
Reactivación de la cepa Crecimiento en medio sólido/líquido Crecimiento en medio líquido

6 DESARROLLO DE INÓCULO Cultivo preservado se reactiva en medio líquido o en medio sólido. Según el método de preservación se requerirá tiempo para la recuperación del cultivo. Sucesivamente se irá incrementando el volumen del recipiente de cultivo, para conseguir la velocidad de crecimiento adecuada.

7 DESARROLLO DE INÓCULO Es vital ir incrementando el volumen para que a escala industrial se alcancen los resultados óptimos. Si el número de células no es el adecuado, la producción no será óptima Además, si crece en condiciones diferentes a como crecerá después (industrialmente), existirá una fase de latencia en el fermentador, reduciendo la rentabilidad.

8 Etapas del desarrollo del inóculo 1. Reactivación de la cepa.
2. Crecimiento del microorganismo en medio sólido o líquido 3. Crecimiento del microorganismo en un medio de cultivo liquido

9 Inóculo Esquema de un fermentador típico para cultivo en suspensión con microorganismos o células animales.

10 Características de los inóculos microbianos utilizados en bioprocesos industriales

11 Fuente Antibióticos Enzimas Cepas silvestres/ Colecciones Aminoácidos
Otras sustancias

12 LA CANTIDAD DEL INÓCULO REQUERIDA PARA EL PROCESO DE FERMENTACIÓN: la cantidad del inóculo que se prepara y se agrega, en la mayoría de los casos, es el 10% del volumen total del trabajo.

13 LA CONCENTRACIÓN DE MICROORGANISMOS EN EL INÓCULO: Cuando el producto deseado es la biomasa, la concentración de microorganismos representa la eficiencia del proceso. Si el interés va dirigido hacia los metabolitos, el mismo parámetro es una medida indirecta de su producción.

14 Factores a considerar:
Concentración de células Alcanzado (inóculo) Concentración celular inicial (fermentación) Concentración inicial sustrato Requerido  Volumen y número de fermentadores disponibles  Fase de crecimiento apropiado Influencia de la cantidad de transferencias sobre el crecimiento y formación de producto Tipos de inóculo, a nivel de: Laboratorio (para investigación y en la etapa temprana de la escala industrial) Producción industrial

15 IMPORTANCIA DEL DESARROLLO DE INÓCULOS

16 IMPORTANCIA DEL DESARROLLO DE INÓCULOS
Para la elaboración de procesos fermentativos . En la industria de los alimentos, panadería, lácteos y otros. Para la optimización de los resultados en los procesos biotecnológicos. En la Comercialización como cultivos liofilizados.

17 Desarrollo de inóculos microbianos empleando lodos activados para la remoción de acido sulfhídrico (H2S) mediante biofiltración Desarrollo de inóculos para la determinación de la DBO: Desarrollo de inóculos de microorganismos lácticos y levaduras para la nutrición y alimentación animal

18 PREPARACIÓN DEL INÓCULO:
El cultivo láctico para yogurt, está constituido por una combinación de Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus al 50%; estos dos microorganismos crecen en simbiosis y ambos son responsables de la fermentación láctica de la leche. Para obtener un buen yogurt, es importante mantener el balance en producciones sucesivas. Los tratamientos severos de temperatura podría inhibir el crecimiento de ST y favorecer el crecimiento de LB. El tratamiento a 90ºC durante algunos minutos inactiva bacteriófagos presentes en la leche. Se prefiere utilizar leche descremada en lugar de leche desengrasada para aumentar los sólidos en el medio de cultivo. Las plantas deben trabajar cercanamente con los distribuidores de los cultivos a fin de monitorear a los fagos.

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22 Desarrollo de inóculo para la producción de metabolitos secundarios
Son moléculas sintetizadas por determinados microorganismos, normalmente en una fase tardía de su ciclo de crecimiento. Características No son necesarios para el crecimiento del microorganismo que los produce. Cada uno de estos productos es producido por un grupo muy reducido de organismos. La producción puede perderse fácilmente por mutación espontánea.

23 Desarrollo de inóculo para la producción de metabolitos secundarios
Los metabolitos secundarios se sintetizan normalmente en idiofase (fase estacionaria) Ejemplos: Antibióticos toxinas (micotoxinas) Alcaloides (ácido lisérgico) Factores de crecimiento vegetal (giberelinas) Pigmentos.

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26 CONSERVACIÓN DEL INÓCULO
El problema de trabajar con microorganismos es su corto tiempo de vida, ya para trabajar con ellos son necesarias sucesivas generaciones que se mantengan idénticas entre sí. Esto puede presentar una serie de problemas. La conservación de cepas de producción en un período largo de tiempo es un requerimiento básico para la fermentación industrial. El objetivo no será solo la supervivencia del organismo, sino que este mantenga sus capacidades de producción después de la conservación. Que se mantenga sin cambios celulares tanto tiempo como sea posible y ha de encontrar el método más adecuado para cada cepa.

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28 FORMAS DE CUANTIFICAR EL INÓCULO

29 FORMAS DE CUANTIFICAR EL INÓCULO
Existen varios métodos para medir la concentración de microorganismo, los mas comunes son: La determinación del número de células Determinación de la masa celular o biomasa

30 La determinación del número de células
Métodos directos : Cuenta total microscópica (Cámara de Neubauer, de Petroff, método de Breed) Cuenta viable (en placa, cuenta en tubo de Hungate, tinción con azul de tripano)

31 Cámara de Neubauer

32 Recuento en placa

33 La determinación del número de células
Métodos indirectos: Espectrofotometría Nefelometría Numero más probable (NMP)

34 Determinación por Nefelometría

35 Determinación de la masa celular
Métodos directos Peso seco Extracción Filtración Desecador Pesado Peso húmedo Volumen húmedo

36 Determinación de la masa celular
Métodos indirectos Determinación de Nitrógeno total: Técnica de micro-Kjeldahl Espectrofotometría Radiación IR

37 Espectrofotometría Cuanto mayor es el número de células en suspensión, tanto menor es el porcentaje de luz que atraviesa el medio.

38 GRACIAS

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40 BIOGAS Materia orgánica CONSORCIO:
Amplio espectro a los excrementos animales y humanos Aguas residuales orgánicas de las industrias (producción de alcohol, procesado de frutas, verduras, lácteos, carnes, alimenticias en general) Restos de cosechas Materia orgánica CONSORCIO: 3 grupos de microorganismos anaerobios fermentación anaerobia BIOGAS Microorganismos en relación simbiótica Pequeñas cantidades de hidrógeno (H), sulfuro de hidrógeno (SH2 ) y nitrógeno (N) Dióxido de carbono (CO2 ) Metano (CH4)

41 La diversidad microbiana en los digestores de biogás es tan grande como la del rumen, donde se han reportado diecisiete especies de bacterias fermentativas que juegan un importante papel para la producción de biogás.

42 Inóculo del Biogás: Excremento de animales conteniendo diferentes grupos de microorganismos, por ejemplo las excretas de animales. Dado las notables diferencias de textura en algunas excretas, se tiene que añadir agua hasta lograrla disolución aproximada de los sólidos en la mezcla, para la activación del inóculo Activación: se disuelve en agua en una relación estiércol agua de 1:3. Luego se homogeniza la mezcla con la ayuda de una varilla de madera. Antes de ingresarlo al biodigestor, se realiza un simple filtrado para evitar que entren sólidos muy grandes y ocasionen la formación de costras sobre los lodos y evite la liberación del biogás.

43 Condiciones del inóculo:
Ausencia de oxígeno disuelto e inhibidores pH de 6.8 a 7.5. Mezclado Presencia suficiente de nutrientes Sólidos totales. Contenido de agua Relación Carbono/Nitrógeno

44 DESARROLLO DE INÓCULO DE Bacillus sp. PARA LA PRODUCCIÓN DE AMILASAS

45 FUENTE DE INÓCULO: - Criopreservación de un cultivo de Bacillus sp.:
Las cepas aisladas y seleccionadas se inoculan en un medio mínimo e incubada a 37°C con agitación orbital a 250 RPM hasta alcanzar una OD de 0.6 a 1.0, posteriormente las bacterias son centrifugadas descartando el sobrenadante y resuspendidas en medio mínimo con glicerol 10%, y se almacenan en viales en nitrógeno líquido. Almacenamiento en nitrógeno líquido PRODUCCION DE BIOMASA Cultivo de Bacillus sp. -80° a -196°C

46 CEPAS CARACTERIZADAS Cepa de B. subtilis BSR6 (ΔnprE, Δamy, hisA, glyB, aprE::lacZ, CmR; Jan et al., 2000). *BSR6 es una derivada de la cepa 168 y tiene una fusión transcripcional aprE-lacZ integrada en el locus amyE de B. subtilis (amyE::pTTGACA cat)

47 DESARROLLO DE INOCULO A) ACTIVACIÓN DE INÓCULO:
Placas con Agar Luria Bertani (LB), las cuales fueron inoculadas con diluciones de las bacterias criopreservadas permitiendo la formación de colonias aisladas. Microorganismo criopreservado Diluciones Medio LB

48 B) PROPAGACIÓN DE INÓCULO: Se toma una colonia aislada de una placa con medio LB y esta se inocula en 50 ml de medio LB (en matraz Erlenmeyer de 250 mL), el cultivo es incubado a 37°C con agitación orbital a 250 rpm,14 horas hasta alcanzar una O.D. de hasta 2.0. Luego las bacterias son centrifugadas y resuspendidas en 10 mL de caldo LB. Colonias aisladas de Bacillus sp. Cultivo de Propagación Cultivo resuspendido

49 Medio Luria Bertani (LB):
-NaCl ……………………………..10 gr. -Bacto-Triptona ………………10 gr. -Extracto de levadura ……… 5 gr. Aforando a 1000 mL con agua destilada con un pH ajustado a 7.0. Agar a una concentración de 1.5% fue utilizado en medio sólido. Otros medios de Propagación: - Medio de cultivo (g/L): Pectina, 2; Extracto de levadura, 1; Peptona de carne, 10; Peptona de soja, 10; KH2PO4, 0,2; CaCl2, 0,05; (NH4)2SO4, 3; MgSO4, 0,8;MnSO4.6H2O, 0,05; FeSO4.7H20, 0,015; pH 5,0. - Medio Basal: caldo nutritivo, 0.8; extracto de levadura, 0.3; almidón soluble, 0.2; KH2P04, 0.1 y K2HP04, 0.3

50 DESARROLLO DE INÓCULO DE A. niger PARA LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO

51 Fuente de inóculo: La conservación de esporas de Aspergillus niger se lleva a cabo mediante: -Congelación (-18°C ó -196°C en Nitrog. líquido), - Secado en suelo estéril o - Liofilización. Estas técnicas de conservación, se usan con éxito para pequeñas cantidades de esporas, pero el elevado costo del equipo y funcionamiento, las hacen de uso limitado para escalas mayores.

52 Método de conservación con aceite mineral
Método usado cuando la criopreservación y la liofilización no resultan económicas. Consiste en recubrir con aceite mineral estéril un cultivo que se encuentre en condiciones optimas de crecimiento, generalmente de usa aceite mineral de alta calidad de grado medicinal.

53 Desarrollo del inóculo:
ACTIVACIÓN DEL INÓCULO: Se usa de preferencia caldo de papa dextrosa (PD), sembrando una cantidad de microorganismo liofilizado en 50 ml de PD (5 días a 30°C ) en un shaker orbital con 150 rpm. Después de activada la cepa, se siembra nuevamente el microorganismo en medio sólido (PDA), manteniéndolo a 30°C por 5 días hasta que se formen las esporas.

54 Al cabo del tiempo de incubación y habiendo esporulado el microorganismo, se guarda para su conservación a 4 ºC. De las cajas de Petri refrigeradas se preparan suspensiones de esporas con una concentración aproximada de 2 x 107 esporas/mL con el fin de favorecer la formación de pellets.

55 Conservación del cultivo

56 Activación del inóculo

57 DESARROLLO DEL INOCULO
SEMINARIO 1 BIOTECNOLOGIA

58 Desarrollo del inóculo
Las técnicas biotecnológicas consisten en la manipulación de los organismos, fundamentalmente a escala genética, para usos especí­ficos. En esos conceptos está comprendida la biotecnología tradicional y la denominada biotecnología moderna en la que la tecnología del ADN recombinante (también llamada ingeniería genética) se ha convertido en parte central de la misma.

59 En el proceso de obtención del producto deseado, los sistemas biológicos actúan como catalizadores de la reacción propiciando que ésta se lleve a cabo en condiciones óptimas y con el mayor rendimiento. Los sistemas biológicos usados son: microorganismos, cultivos celulares, enzimas o esporas. De todos ellos destacan los microorganismos debido a dos razones fundamentales: su elevada diversidad y plasticidad metabólica y la sencillez y economía de su cultivo. La operación tiene dos fases: la de preparación, incluyendo la fermentación, y la de obtención del producto.

60 Los aspectos clave de esta etapa consisten en: la localización de un microorganismo de interés industrial. Normalmente ese microorganismo provendrá de colecciones o bien de las cepas salvajes existentes en la naturaleza

61 La producción de bioetanol, es un ejemplo de mucho interés
La producción de bioetanol, es un ejemplo de mucho interés. La materia prima usada en la fermentación para producirlo consiste típicamente en una mezcla de hexosas y pentosas. Por tanto el bioetanol es el producto de la transformación de una mezcla de sustratos mediante microorganismos.

62 Cuando un microorganismo crece en presencia de al menos dos sustratos, uno de ellos es normalmente agotado primero, lo que resulta en un cambio en la pendiente de la curva de crecimiento de biomasa. La población de levaduras usadas en la producción de bioetanol, a escala industrial, puede variar de acuerdo con las condiciones particulares del proceso de cada planta así como del estrés que el ambiente fermentativo impone a los consorcios de microorganismos. Por ello, las levaduras aisladas de una industria en particular pueden estar adaptadas a dichas condiciones y por tanto son mejores para ese proceso que una cepa comercial pura.

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67 Propagación: Manejo: Dirección y gobierno de un negocio. En microbiología hace referencia a dirigir una secuencia correcta de un procedimiento o proceso.

68 cultivo preservado se reactiva en medio líquido en agitación o en medio sólido, en condiciones adecuadas para la fermentación posterior. Según el método de preservación se requerirá más o menos tiempo para la recuperación del cultivo. Sucesivamente se irá incrementando el volumen del recipiente de cultivo, para conseguir la velocidad de crecimiento adecuada. Es vital ir incrementando el volumen para que a escala industrial se alcancen los resultados óptimos. Si el número de células no está en el número adecuado, la producción no será adecuada. Además, si crece en condiciones diferentes a como crecerá después, existirá una fase de latencia en el fermentador, reduciendo la rentabilidad.

69 Inóculo: Suspensión de microorganismos que se transfieren a un ser vivo o a un medio de cultivo a través de la inoculación. Por otra parte: Un inoculo microbiano es una preparación solida o líquida la cual contiene una gran cantidad de microorganismos. Crecimiento: Dicho de un ser orgánico: Tomar aumento natural (se dice principalmente de la estatura). En microbiología, la palabra crecimiento se define como un incremento en el número de células.

70 Microorganismos viables
Preparación del inóculo. Conservación Microorganismos viables

71 Métodos de conservación.
Resiembra:

72 Consiste en remover el agua celular e impedir la rehidratación de las células de los microorganismos. La Desecación

73 La congelación: Temperaturas entre -150 y -196 ºC.
Ordinaria Temperaturas entre -5 y -20 ºC. Ultrafría Temperaturas entre -50 y -80 ºC. Nitrógeno líquido Temperaturas entre -150 y -196 ºC.

74 Es la remoción de agua de células congeladas a presión reducida (sublimación).
La liofilización

75 Fases de produccion de inóculo.
Fase de laboratório Fase industrial Fases de produccion de inóculo.

76 DESARROLLO DE INÓCULO

77 DESARROLLO DE INÓCULO

78 DESARROLLO DE INÓCULO