Introducción a técnicas de ingeniería genética

Presentación del tema: "Introducción a técnicas de ingeniería genética"— Transcripción de la presentación:

1 Introducción a técnicas de ingeniería genética
Oriana Salazar Centro de Ingeniería Bioquímica y Biotecnología FCFM Universidad de Chile 24 Agosto 2010

2 Temario Breve introducción a los métodos de DNA recombinante
Métodos de ingeniería de proteínas Mutagénesis sitio Dirigido Mutagénesis al azar Estrategias de modificación genética de microorganismos Aplicación a enzimas y microorganismos usados en la producción de biocombustibles

3 Lípidos de membrana DNA Proteínas
La célula es la unidad biológica fundamental, formada por tres tipos de macromoléculas: proteínas, lípidos y ácidos nucleicos Lípidos de membrana DNA Proteínas

4 Proteínas Cuatro posibles niveles de estructura:
Polímeros de amino ácidos asociados en una cadena lineal. Estructura primaria (secuencia) Estructura secundaria Estructura terciaria Estructura cuaternaria

5 DNA versus RNA RNA: una hebra Uracilo en lugar de timina
Azúcar es ribosa, no desoxirribosa com en DNA

6 EL ADN es el material genético
Exterior: Azúcar + fosfatos Interior: bases nitrogenadas formando puentes de Hidrógeno

7 Un gen es un fragmento de DNA que codifica para una proteína
Expresión de los genes Un gen es un fragmento de DNA que codifica para una proteína promotor Region codificante RNA polimerasa ribosomas

8

9 Ala-Met-Tyr Trp-Phe-Leu
Traduciendo el mensaje del mRNA mRNA AGGCUUAGACCGAGU CODIGO GENETICO Proteínas Ala-Met-Tyr Trp-Phe-Leu

10 Tres “letras” (nucleótidos) significan un aminoácido

11 La traducción del mensaje genético en el RNA se realiza a través del CÓDIGO GENÉTICO

12 Clonamiento de un gen

13

14 Un vector de expresión: usado para producir proteínas recombinantes
Proteína recombinante Cromosoma bacteriano

15 Ingeniería de proteínas
Modificación de la secuencia de aminoácidos de una proteína efectuados a nivel de gen (ADN) de la enzima. Gen de la enzima debe estar clonado Producción recombinante de la enzima en microorganismos

16 Limitaciones de las enzimas industriales
Baja actividad catalítica Baja estabilidad frente a la temperatura, al pH, a los solventes del medio, etc. Especificidad de sustrato diferente a la deseada. Necesidad de efectores auxiliares de alto valor económico

17 Ingeniería de proteínas
Los objetivos de la I.P. al modificar la secuencia de una proteína son: Alcanzar una mejor comprensión de las relaciones estructura-función Obtener un cambio deseado en alguna propiedad de la proteína

18 Los estudios de las relaciones estructura función permiten conocer las regiones de la estructura que son importantes para la actividad (función) de la enzima celulosa glucosa celulasa Región catalítica Región que une celulosa sustrato

19 Estrategias para hacer ingeniería de enzimas
Estrategia racional Requiere información estructural y funcional previa (estructura). El investigador decide en base a la información disponible, qué aminoácido cambiar y por cual. Estrategia al azar o combinatorial Independiente de información previa Se generan múltiples variantes de la proteína y se selecciona la que tiene la propiedad de interés.

20 ESQUEMA DEL DISEÑO RACIONAL DE PROTEÍNAS
ESTRUCTURA DE PROTEINAS MODELAMIENTO MOLECULAR BASADO EN ESTRUCTURA MUTAGENESIS SITIO DIRIGIDO TRANSFORMACION Y EXPRESION CARACTERIZACION DE MUTANTES

21 Mutagénesis sitio dirigido
GEN SILVESTRE GEN MUTADO TGTGTCCCAAAGTTCTATACGCTG ACACAGGGTTTCAAGATATGCGAC TGTGTCCCAGACTTCTATACGCTG ACACAGGGTCTGAAGATATGCGAC Asp PROTEINA SILVESTRE PROTEINA MUTADA

22 Ingeniería de proteínas por evolución dirigida

23 Evolución dirigida requiere del análisis masivo de miles de variantes de la enzima
De una proteína de 300 aminoácidos se pueden generar 19 x 300 = 5700 variantes con un solo cambio

24 ROBOT PIPETEADOR PIPETA DIGITAL MULTICANAL MICROPLACAS DE 96 POCILLOS