2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS

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1 2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS
PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA LACTATO DESHIDROGENASA DE MÚSCULO ESQUELÉTICO DE POLLO PARTE II. PURIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Y DE AFINIDAD

2 Parte I. Extracción y precipitación por desalado
ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS: PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA LACTATO DESHIDROGENASA DE MÚSCULO ESQUELÉTICO DE POLLO Parte I. Extracción y precipitación por desalado Parte II. PURIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Y DE AFINIDAD Parte III. Monitoreo del proceso de purificación. A. Determinación de la concentración de proteínas. Parte III. Monitoreo del proceso de purificación. B. Separación de las proteínas en gel de poliacrilamida-SDS.

3 Propiedades de las proteínas para tomar en cuenta en la separación y purificación por cromatografía.
Tamaño (masa molecular) Carga Hidrofobicidad Unión específica al ligando.

4 CROMATOGRAFÍA: Contexto histórico.
En 1910 fue descrita por primera vez esta técnica por el botánico ruso M. Tswett para separar pigmentos de plantas. Le dio el nombre de cromatografía por las bandas de colores que se separaban. Se utilizaron columnas de yeso. No fue hasta 1930 que fue redescubierta, que la técnica se fue extendiendo y haciendo versiones de la misma. El desarrollo de la cromatografía de gas-líquido (Martin y James, 1952) encontró rápidamente aplicaciones de gran e importancia y estableció el inicio del desarrollo de la teoría de separación cromatográfica (Van Deemter, 1956; Giddings, 1965, etc . Actualmente no hay un campo de la Química, Biología y Medicina que no utilice la cromatografía en alguna de sus formas.

5 CROMATOGRAFÍA Es un método físico de separación de los componentes de mezclas complejas. Los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una inmóvil (fase estacionaria) y otra móvil (fase móvil), la cual percola a través de la primera. El extracto crudo se aplica en la parte superior de la columna y va poco a poco entrando en la columna con la fase móvil. Cada proteína migrará a distinta velocidad según su grado de afinidad por la fase estacionaria. Generalmente se realizan de una forma semiautomática, la fase móvil se hace pasar a la columna a través de una bomba peristáltica y un colector de fracciones va recogiendo el eluyente que sale de columna. Este colector hace que el tubo vaya cambiando cada cierto número de gotas o de volumen. Después hay que localizar en que tubo o tubos está la proteína que se pretende purificar.

6 Matriz: Sustancia con la que se empaqueta la columna y constituye la fase estacionaria también conocida como lecho de columna. Fase móvil: Conocido como eluyente. Es una solución tamponada (buffer) que se emplea para transportar solutos a través de una fase estacionaria. Volumen de columna: Volumen total de la sustancia con la que se empaqueta una columna cromatográfica. Volumen muerto de la columna: Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. Volumen de elución de soluto: Cantidad de solvente necesaria para eluir el soluto de la columna.

7 Fase estacionaria (propiedades)
Se le denomina matriz o resina Químicamente Inerte Porosa

8 Se utilizan matrices o soportes muy variados.
Sobre la matriz se van a dar las interacciones que resultan en la interacción, por lo que estas matrices van a llevar los grupos químicos encargados de dicha interacción o su estructura tiene alguna propiedad intrínseca que le permite la separación. Matrices inorgánicas: Sílica porosa Vidrio de poro controlado Hidroxiapatita Polímeros sintéticos: Poliestireno (Resina con cierta hidrofobicidad) Poliacrilamida (Biogel-P) Polimetaacrilato Polisacáridos Celulosa (Cellulafine, Sephacel) Dextrano (Sephadex) Agarosa (Sepharosa, Superosa, Ultragel A, Biogel) Polímero orgánico polisacarido: Poli N,N´ - Bisacrilamida-dentrano (sephcryl) Agarosa – Dextrano (Superdex) Agarosa – Poliacrilamida (Utradex AA)

9 Fase móvil Conocido como eluyente. Es una solución tamponada (buffer) que se emplea para transportar solutos a través de una fase estacionaria. Puede ser constate o variable. La composición depende de las condiciones de la cromatografía y de la composición de la mezcla que se quiere separar, el método que se va a utilizar y propiedades físicas y químicas de la proteína.

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11 Vt (Volumen total): Volumen que ocupa el cilindro del gel hidratado.
Vo (Volumen vacío): Volumen existente entre las esferas del gel. Vt-Vo: Volumen ocupado por las esferas del gel, que se expresa como la diferencia de los dos volúmenes anteriores.

12 Pasos para purificar proteína por cromatografía:
Empacar la columna Equilibrar la columna Aplicar la muestra Lavado (algunos casos) Eluir la muestra Colectar el eluato Detectar y cuantificar las proteínas

13 Tipos de cromatografía
Cromatografía de Adsorción: La separación depende de las diferencias de adsorción – desorción de los componentes de la mezcla, entre la fase móvil y la fase estacionaria. La fuerza de adsorción depende de la polaridad. Las moléculas se unen a la matriz y son eluidas al cambiar la composición del eluyente. Cromatografía de partición: La separación depende de las diferencias en la movilidad de las moléculas en el líquido (fase móvil) al atravesar la matriz.

14 Mecanismos de separación
Las técnicas cromatográficas pueden clasificarse en función del mecanismo de separación de los componentes entre sus fases, así como en la retención selectiva, permitiendo separar los distintos componentes de la mezcla para hacer su identificación y determinación. Existen distintos tipos cromatografía: Cromatografía de filtración en gel o exclusión molecular. Cromatografía de intercambio iónico. Cromatografía de interacción hidrofóbica Cromatografía de afinidad

15 Cromatografía de exclusión molecular (Filtración en gel)
Permite la separación de las moléculas en función de su tamaño. La fase estacionaria está conformada por partículas de polímeros de diferente porosidad. Las proteínas de mayor tamaño no pueden penetrar en los poros de las partículas de la matriz y son eluidas rápidamente. Las partículas pequeñas penetran los poros siguiendo un camino largo. El tamaño de los poros internos depende de la naturaleza del polímero y permite la entrada a proteínas por debajo de su peso molecular.

16 Matriz de la cromatografía de exclusión molecular es un material poroso e hidratado.
El polímero debe ser: Inerte Sin carga. Con tamaño de poro inerte. Materiales: Dextranos con enlaces cruzados. Agarosa Poliacrilamida

17 Tipos de matrices

18 Otras matrices…

19 Más matrices…

20 Cromatograma de purificación por cromatografía de exclusión molecular

21 Separación de biomoléculas de diferentes tamaños
Aplicaciones Desalado Separación de biomoléculas de diferentes tamaños Purificación de proteínas Determinación de la masa molecular de las proteínas Determinación de la masa molecular de las proteínas El volumen de elución es proporcional al logaritmo de la masa molecular.

22 Cromatografía de intercambio iónico
Permite la separación de las moléculas con base a su carga neta. Las proteínas cargadas pueden unirse a intercambiadores aniónicos o catiónicos dependiendo de su carga neta. Las proteínas más cargadas se unirán más fuertemente al intercambiador y serán más difíciles de eluir. La afinidad con la que se une la proteína al intercambiador iónico depende de la fuerza iónica del medio determinada por el pH, debido a la competencia de los grupos cargados de la proteína y los iones del medio. Para eluir las proteínas se debe aumentar la fuerza iónica del medio.

23 Carga de las proteínas Es la suma de las cargas de las cadenas laterales de los aminoácidos Depende del pH del medio La distribución de la carga neta en la superficie de la proteína determina la interacción con los grupos cargados en la superficie del material de empaque de la columna (matriz).

24 Punto isoeléctrico Valor de pH en el que una molécula no tiene carga neta. Es decir que el número de cargas positivas y cargas negativas son iguales, por lo tanto la carga neta es igual a 0. pH solución > pI = proteína con carga (-) desprotonación. pH solución < pI = proteína con carga (+) protonación pH solución = pI = proteína con carga (0) Precipitado insoluble

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26 Matriz La columna va rellena con un soporte al que van unidos grupos cargados positivamente (intercambio aniónico) o negativamente (intercambio catiónico) los cuales están neutralizados con iones tampón que son reemplazados por las proteínas. La proteína se une ala intercambiador a través de interacciones electrostáticas reversibles Proteína carga (+) – intercambiador carga (-) Proteína carga (-) – intercambiador carga (+)

27 Sustitución de las cargas en cromatografía de intercambio iónico

28 Acrilamida (dextranos)
En cromatografía de intercambio aniónico se utilizan tres tipos de materiales: resinas, geles y celulosas. Sepharosa Acrilamida (dextranos) Celulosa Sephadex Intercambiador anionico Intercambiador cationico

29 Grupos químicos que forman parte de las matrices intercambiadoras y que le dan la carga
aniónico Intercambiador catiónico

30 Factores que afectan la retención de las proteínas en la matriz pH
Fuerza iónica Para eluir las proteínas es necesario una solución tampón salina. La elución de las proteínas puede ser de diferentes maneras, aunque la más usual consiste en aumentar progresivamente la concentración de sales (NaCl, NaK, etc.)

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32 Monitoreo de la purificación

33 Tipos de elución Elución isocrática: Composición constante de la fase móvil (eluyente). Elución en gradiente: Composición variable de la fase móvil, el eluyente se modifica a lo largo de la cromatografía.

34 Cromatografía de interacción hidrofóbica
Es un método muy similar a la cromatografía de intercambio iónico, con la única diferencia de que la fase estacionaria es apolar (hidrofóbica). La proteína se pega a la matriz por los restos de aminoácidos apolares. Entre mayor cantidad de residuos apolares en la superficie, mayor tiempo se retendrá en la columna y eluirá más tarde. La unión es mayor a concentraciones altas de sales. Para eluir la proteína se utilizan concentraciones decrecientes de sales.

35 Esta técnica consiste en unir biomoléculas de interés a la matriz en un entorno altamente hidrofílico y con una fuerza iónica elevada con concentraciones elevadas de sales (NaCl, KCl, (NH4)2 SO4). La elución se realiza con una solución con concentraciones decrecientes de sales y con solventes con cierto grado de hidrofobicidad (etilenglicol, glicerol, etanol, etc.). Interacciones con Leu, Ile, Val, Phe, entre otros.

36 Las matrices usadas pueden ser:
Superosa Sepharosa Sephadex unidas a grupos químicos hidrofóbicos. Los grupos fenil son de unión fuerte. Los grupos butil son de unión débil.

37 Monitoreo de purificación (Perfil cromatográfico)

38 Cromatografía de afinidad
Se basa en la unión de proteínas con ligandos unidos a una matriz de forma muy específica

39 Los ligando pueden ser:
Sustrato Cofactor Inhibidor Coenzima Iones metálicos Hormonas Anticuerpos, etc.

40 La cromatografía de afinidad se basa en la alta especificidad de las moléculas biológicas por sus ligandos, mediante el reconocimiento molecular.

41 Los ligandos se unen covalentemente a la matriz y tienen una alta capacidad de unir proteínas.
La matrices pueden ser diversas: agarosa, dextranos, acrilamidas, etc.

42 La elución se realiza: Incrementando la concentración de sal en el medio de lavado Adicionando el ligando en forma soluble (más frecuente). Cambiando el pH de la solución de lavado.

43 Ejercicio

44 Práctica: Purificación de la enzima Lactato Deshidrogenasa (LDH) de músculo esquelético de pollo. PARTE II: PURIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Y DE AFINIDAD

45 En que nos quedamos…

46 Que continua… Objetivos: Aplicar la cromatografía en filtración en gel como una de las técnicas para el desalado y cambio de solución amortiguadora de extractos proteicos. Aplicar los métodos de cromatografía de intercambio iónico y de afinidad para purificar una proteína.

47 Para purificar la proteína debemos tener en cuenta:
Peso molecular Punto isoeléctrico (pI) Carga neta de la proteína a pH 6.5 ¿Qué intercambiador necesitamos? Posibles ligandos

48 Desalado Sephadex G-25 Purificación por Cromatografía de afinidad DEAE affi-gel blue gel Purificación por Cromatografía de intercambio iónico Macro-Prep High S de Biorad

49 NOTA: En esta práctica se realizará la cuantificación de proteínas.

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