resistentes para la producción de bioetanol de segunda generación”

Presentación del tema: "resistentes para la producción de bioetanol de segunda generación”"— Transcripción de la presentación:

1 resistentes para la producción de bioetanol de segunda generación”
“Ingeniería Evolutiva en ácido acético: en búsqueda de clones de levadura resistentes para la producción de bioetanol de segunda generación” Gurdo, Nicolás1; Novelli, Guido2; Juárez, Ángela3; Portal, Patricio1; Miguel Galvagno1,2. 1Instituto de Investigaciones Biotecnológicas “Dr. Rodolfo Ugalde” (IIB-UNSAM) – Universidad Nacional de San Martín (UNSAM) Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), San Martín, Buenos Aires, Argentina. 2Departamento de Ingeniería Química, Facultad de Ingeniería, Universidad de Buenos Aires, Pabellón de Industrias, Ciudad Universitaria, CABA, Argentina. 3Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental - IBBEA-CONICET y Departamento de Química Biológica Universidad de Buenos Aires, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Ciudad Universitaria, Buenos Aires, Argentina. INTRODUCCIÓN Introducción. Saccharomyces cerevisiae es la levadura más utilizada para la producción de bioetanol de segunda generación (BE2G) a partir de residuos lignocelulósicos, ya que su metabolismo es ampliamente conocido y además por su tolerancia frente a múltiples condiciones de estrés durante la etapa de fermentación. A lo largo del proceso de producción de bioetanol y especialmente en la etapa de fermentación alcohólica, la célula de levadura sufre diferentes condiciones de estrés como elevada concentración de etanol, altas temperaturas, presión osmótica y estrés oxidativo. En la producción BE2G a partir de biomasa lignocelulósica, es necesario llevar a cabo el siguiente proceso: pre-tratamiento fisicoquímico de la biomasa, hidrólisis enzimática de la biomasa, fermentación y destilación eventual para separar el etanol. El objetivo del tratamiento fisicoquímico es liberar azúcares fermentables capaces de ser metabolizados por el microorganismo y exponer principalmente la celulosa a la hidrólisis enzimática. Como consecuencia de este procedimiento, en el medio de cultivo se generan compuestos tóxicos (furfurales, ácidos orgánicos, derivados de hexosas y pentosas y también compuestos fenólicos) que tienen la capacidad de inhibir el crecimiento celular y por lo tanto la productividad de etanol. Como consecuencia del alto metabolismo celular se generan especies reactivas de oxígeno (EROs) como el radical anión superóxido (O2-), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (•OH) los cuales generan un desbalance en el estado de óxido-reducción de la célula . La levadura S. cerevisiae posee una red de mecanismos de defensa que permiten la protección frente al estrés oxidativo. La defensa primaria incluye enzimas que protegen a las células removiendo las EROs o secuestran iones metálicos, mientras tanto, las defensas secundarias comprenden enzimas que remueven y reparan los componentes dañados. Los mecanismos de defensa primaria incluyen enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT) y la Glutation S transferasa (GST). Es posible incrementar la robustez de las levaduras de laboratorio o industriales utilizando principalmente dos enfoques: a) las transformaciones genéticas (ingeniería genética o metabólica) con las que generalmente no se logran valores de producción compatibles a la escala industrial, o b) manipulaciones predominantemente fenotípicas incluidas las adaptaciones evolutivas a través de la técnica de ingeniería evolutiva. La adaptación evolutiva al medio de cultivo o a un compuesto inhibidor es una estrategia poderosa que consiste en someter a las cepas a una presión selectiva constante y creciente con el fin de incrementar la resistencia a las distintas condiciones de estrés. Este trabajo explora las bases de la adaptación evolutiva y la respuesta fisiológica de la levadura Saccharomyces cerevisiae en un contexto de estrés metabólico generado por las condiciones ambientales propias de un proceso de producción de bioetanol de segunda generación. Ingeniería Adaptativa – Procedimientos y Resultados. Cepas, medios de cultivo y reactivos: La cepa industrial osmotolerante Saccharomyces cerevisiae Y8, fue utilizada en los experimentos de ingeniería evolutiva. La cepa industrial y los clones obtenidos a partir de ella fueron mantenidos en medio YPD agar (extracto de levadura 10 g/l, peptona 20 g/l, glucosa 20 g/l y agar 20 g/l). Los cultivos líquidos se realizaron en medio YPD. Todos los pre-cultivos fueron incubados 14 horas en medio YPD a 28°C y 250 rpm en un agitador rotatorio, en frascos Erlenmeyer con una relación 5:1 (volumen de frasco: volumen de medio). A partir de ellos, se inocularon los cultivos experimentales en el mismo medio y bajo las mismas condiciones de temperatura y agitación que los pre-cultivos, durante los tiempos correspondientes a cada ensayo. 2. Adaptación evolutiva en ácido acético: A partir de la cepa osmotolerante de Saccharomyces cerevisiae Y8, se realizaron cultivos batch a repetición en medio YPD con concentraciones crecientes de ácido acético a 28°C y 250 rpm. Cuando el cultivo batch alcanzaba una concentración celular ≈ 10 DO600nm, la cual corresponde a la etapa exponencial intermedia, se realizaron pasajes de 100 μl a los sucesivos batch aumentando la concentración de ácido acético a partir de 3 g/L hasta no observar crecimiento, según metodología descripta por Wallace-Salinas (Wallace-Salinas et al., 2013). En el último cultivo batch, la población resistente fue almacenada en glicerol 20% v/v a -80°C: 3. Selección de un clon resistente a ácido acético: Luego de la adaptación en medio con ácido acético, los stocks fueron sembrados en presencia de ácido acético utilizando placas de YPD con 5 g/l de ácido acético. La primer colonia/clon en aparecer fue seleccionada para los ensayos posteriores. El clon seleccionado fue denominado Y8A mientras que la cepa parental Y8P. 4. Evaluación de la tolerancia innata al ácido acético: La cepa parental Y8P y el clon Y8A fueron evaluados en presencia de diferentes concentraciones de ácido acético (6, 8 y 10 g/l) a distintos tiempos (2,4 y 6 horas). Se cuantificaron UFC/ml en los distintos ensayos. Los experimentos fueron realizados a 28°C. Resultados: La cepa Y8P parental y el clon adaptado Y8A fueron evaluados en presencia de concentraciones crecientes de ácido acético (6, 8 y 10 g/l) a distintos tiempos (2, 4 y 6 h). Se observó una rápida disminución de la UFC/ml en las concentraciones de 8 y 10 g/l de ácido acético para la cepa parental. En contraste, el clon adaptado Y8A resistió condiciones con mayor concentración de ácido y mayor tiempo de exposición (Figura 1). En todas las condiciones ensayadas, el porcentaje de sobrevida fue mayor en el clon adaptado Y8A que en la cepa parental Y8P. Este resultado indicó que la tolerancia al ácido acético de Y8A (definida como el porcentaje de supervivencia) mejoró durante el proceso de evolución adaptativa en ácido acético. 5. Evaluación de crecimiento celular en medio con ácido acético: La cepa Y8P y el clon Y8A fueron cultivados por triplicado en frascos Erlenmeyers de 100 ml con 20 ml de medio de cultivo YPD a 28°C y 250 rpm con un inóculo inicial de DO600nm/ml=1. A cada cultivo se le adicionó ácido acético en concentraciones de 0, 6, 8 y 10 g/l y se evaluó el crecimiento celular mediante medición de la biomasa (DO600nm). Resultados: A partir de los cultivos realizados en batch en presencia de distintas concentraciones de ácido acético (0, 6, 8 y 10 g/l) se analizó el comportamiento a lo largo de 96 horas de la cepa Y8P y el clon adaptado Y8A. Como puede observarse en la Figura 2 las condiciones control (sin ácido acético) y 10 g/l de ácido acético no mostraron diferencias significativas entre ambos clones analizados. Sin embargo, el clon adaptadoY8A alcanzó niveles de biomasa mayores en comparación al clon parental a partir de las 48 horas en el medio YPD conteniendo 8 g/l de ácido acético y a las 72 horas en el medio con 6 g/l de ácido acético. 6. Ensayos en diferentes condiciones de estrés: La cepa Y8P y el clon Y8A fueron cultivados durante 14 horas en 5 ml de medio YPD. Se inocularon 500 μl de cada cultivo en frascos Erlenmeyers de 100 ml conteniendo 20 ml de YPD y se incubaron por 4 hs a 28°C y 250 rpm. Se monitoreó la concentración celular (DO600nm) y se tomó el volumen correspondiente para obtener una concentración final de células de DO600nm= 1. Se lavaron las células con buffer fosfato de potasio 0,1M (pH=6) y se realizaron los siguientes tratamientos: etanol (10% v/v por 1 h), ácido acético (5 g/l por 2 h), temperatura (42°C por 2 h), sorbitol (3M por 3 h), congelado-descongelado (2 ciclos de 24 h), ácido fórmico (20 mM por 30 min), NaCl (1,5 M por 4 h), ácido gálico (15 mM por 4 h) y H2O2 (5 mM – 1 h). Se retiró la fuente de estrés lavando el cultivo con buffer fosfato de potasio 0,1M (pH=6) y se realizaron diluciones seriadas al décimo ( ). Se sembraron 100 μl de la dilución adecuada en YPD agar y se incubaron las placas a 28°C por 48 hs. Además, de cada una de las diluciones se plaquearon 10 μl en YPD agar en forma de gota (spot assay). Resultados: Para realizar estos experimentos se eligieron un conjunto de estrés en pos de imitar los distintos daños que puede sufrir la célula de levadura. El primer conjunto de estrés estudiado fue la alta temperatura, etanol, peróxido de hidrógeno, sorbitol y congelado-descongelado. El segundo conjunto de estrés estudiado corresponde a inhibidores que pueden encontrarse presentes en el hidrolizado lignocelulósico utilizado para su fermentación. Los inhibidores estudiados fueron: ácido acético, ácido fórmico y ácido gálico y como otro parámetro de toxicidad el NaCl. Los estudios se llevaron a cabo con células en fase exponencial y se comparó el porcentaje de sobrevida luego de los tratamientos en las diferentes condiciones de estrés. El clon Y8A obtenido por ingeniería evolutiva mostró una mayor tolerancia frente a todas las condiciones de estrés ensayadas excepto para el ácido fórmico. Cabe destacar que estos resultados coinciden con el principio de co-tolerancia a distintos tipos de estrés encontrados en S. cerevisiae (Lewis et al., 1997). 7. Determinación de especies reactivas del oxígeno (EROs) y enzimas detoxificantes: Este ensayo fue realizado en colaboración con la Dra. Ángela Beatriz Juárez en el Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental de la Universidad de Buenos. Para ello, la cepa parental Y8P y el clon adaptado Y8A fueron utilizadas para la determinación de EROs y enzimas detoxificantes. Para tal fin las mismas fueron inoculadas en frascos Erlenmeyers de 50 ml con 10 ml de medio YPD (relación medio de cultivo: volumen del erlenmeyer 1:5) e incubadas a 28°C y 250 rpm por 24 hs (pre-inóculo). Luego se tomaron 2 ml de cada pre-inóculo y se inocularon Erlenmeyer de 250 ml con 50 ml de medio YPD y se incubaron nuevamente a 28°C y 250 rpm por 18 horas (inóculo). Luego de dicha incubación, se determinó el número de células por ml en cámara de Neubauer. Posteriormente, se tomaron alícuotas de 5 ml de cada una de las cepas y se colocaron en tubos Falcon de 15 ml. Se centrifugaron a 5000 rpm por 10 min, se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 5 ml de medio YP (1% extracto de levadura y 2% peptona de carne) con H2O2 como condición de estrés (Control: sin H2O2; Estrés suave: 5 mM H2O2 y Estrés fuerte: 100 mM H2O2, todas estas condiciones fueron mantenidas por 2 hs a 28°C). Todos los ensayos fueron realizados por triplicado. Las especies reactivas del oxígeno (EROs) se midieron por fluorometría utilizando 2´,7´diclorodihidrofluoresceína diacetato (H2DCFDA) (Zhang et al, 2003) [12]. La actividad catalasa (CAT) fue determinada monitoreando la cinética de degradación del H2O2 según Aebi Glutatión-S-Transferasa (GST) se evaluó mediante la detección del producto de conjugación del glutatión reducido (GSH) con el reactivo 1-cloro-2,4 dinitrobenceno (CDNB). Dicha conjugación es catalizada por la GST, y el conjugado resultante (GS-DNB) se detectó a 340 nm según Habig WH et al, Por último, La actividad de la superóxido dismutasa (SOD) se determinó según Beauchamp y Fridovich, Este método se basa en la inhibición de la reducción fotoquímica del nitroblue tetrazolium (NBT). Figura 4. Ensayos bioquímicos con baja concentración de H2O2 (5 mM) y alta concentración de H2O2 (100 mM). ROS (A), actividad CAT (B), actividad GST (C) y actividad SOD (D). One-way ANOVA y Bonferroni post-prueba de comparación múltiple. * P <0,05, ** p <0,01. Resultados: Se observó que el nivel de EROs no cambió significativamente en el caso del clon adaptado Y8A bajo el tratamiento de H2O2 (Figura 4A). Por otra parte, se observó un incremento significativo en los niveles de EROs de estado de la cepa parental Y8P en ambas condiciones de estrés. Este resultado sugiere que la cepa parental Y8P fue más susceptibles al estrés oxidativo en tal condición de estrés en comparación con el clon adaptado Y8A que mantiene el nivel de equilibrio redox de la célula. Además, se observaron diferencias significativas en la actividad de la enzima CAT en la condición de control entre Y8P y Y8A (Figura 4A). Como resultado del aumento en los niveles de EROs, el clon adaptado elevó los niveles de actividad de la enzima CAT. Además, en el clon adaptado Y8A los niveles de actividad CAT se mantuvieron elevados cuando se compara con la cepa parental Y8P (Figura 4B). Probablemente, la actividad CAT en las condiciones de control y estrés fuerte podría conferir tolerancia a otras condiciones de estrés presentadas anteriormente en este trabajo (temperatura, etanol, osmótica, congelación, NaCl y ácido acético). De forma similar, la actividad de la enzima GST en el clon adaptado Y8A se mantuvo elevada tanto en el control como en la condición de baja concentración de H2O2 pero no en altas concentraciones Para la Y8P parental, los niveles de actividad GST no variaron a lo largo del experimento (Figura 4C). Los altos niveles en la actividad GST de la cepa adaptada también pueden estar involucrados en mantener los niveles de EROs (o bien los niveles más altos de actividad GST en la cepa adaptada también podrían explicar que los niveles de EROs se mantengan cercanos a los de la cepa en condiciones control). Finalmente, la actividad de la enzima SOD de la cepa parental y adaptada después de las condiciones de estrés no mostró diferencias significativas, por lo que esta enzima no estaría involucrada en la respuesta al estrés inducida por peróxido. Las enzimas SOD juegan un papel importante en la desintoxicación del anión superóxido generada en la cadena respiratoria mitocondrial (Herrero E. et al, 2008) pero la SOD no parece ser específica para la defensa contra H2O2 (Figura 4D). Las observaciones pueden sugerir que esta enzima no sería decisiva en esta tolerancia al estrés oxidativo. Estos resultados indicaron que el aumento de la tolerancia a las condiciones de estrés oxidativo observado en el clon adaptado Y8A, sería conferido por la alta actividad basal de la enzima desintoxicante GST y la enzima antioxidante CAT. 8. Perfil de la producción de bioetanol en presencia de ácido acético: Las fermentaciones alcohólicas se llevaron a cabo en Erlenmeyers de 50 ml en YPD con diferentes concentraciones de ácido acético (0, 6, 8 g/l). Para los pre-inóculo, las células se cultivaron ON en YPD y luego se inoculó en un nuevo medio fresco (inóculo). La concentración inicial de células de los cultivos de las fermentaciones se ajustarona una DO600nm de 0,5. Los Erlenmeyers se incubaron a 28 ° C en un agitador orbital sin agitación durante 96 h. La concentración de bioetanol se determinó enzimáticamente a partir de sobrenadantes de alícuotas de los cultivos. Utilizando el kit proporcionado por R-Biopharm (R-Biopharm AG, Darmstadt, Alemania), basada en la reacción de la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH). Resultados: Las fermentaciones anaeróbicas fueron llevadas a cabo a 28ºC en medio de cultivo YPD con diferentes concentraciones de ácido acético utilizando el clon adaptado Y8A y la cepa parental Y8P. En la condición control, no se observaron diferencias significativas al final de la fermentación entre Y8P y Y8A donde se produjeron cantidades similares de etanol en todas las condiciones (7,91 y 7,96 g.l-1). Por el contrario, se observó un incremento significativo en la producción de etanol por parte del clon adaptado de 53% y 25,5% en las condiciones de 6 y 8 g.l -1 luego de 48 horas transcurrido el ensayo respectivamente . Conclusiones: Se pudo demostrar que la técnica ingeniería evolutiva es una herramienta poderosa para generar clones resistentes a un rango más amplio de condiciones de estrés. A través de la estrategia de adaptación evolutiva en medio de cultivo con ácido acético se logró obtener un clon denominado Y8A con la capacidad de tolerar y resistir un abanico más amplio de condiciones de estrés (etanol, temperatura, NaCl, sorbitol, ácido acético, ácido fórmico, ácido gálico, peróxido de hidrógeno, congelado descongelado) en comparación con la cepa parental Y8P. La elevada actividad basal de CAT y GST en el clon adaptado Y8A , podría conferir resistencia a condiciones oxidativas. Este aumento de resistencia del clon adaptado Y8A coincide con un incremento significativo en la producción de bioetanol en presencia de ácido acético como condición de estrés en comparación con la cepa de origen. Control T°C Etanol Sorbitol C-D H2O2 Control HAc Hfor NaCl HGal 1 2 3 4 5 6 Presión osmótica Estrés oxidativo Elevada temperatura Altos niveles de inhibidores y ácido orgánicos Alta concentración de etanol Figura 1. Crecimiento de células de levadura bajo diferentes concentraciones de ácido acético (0, 6, 8 y 10 g.l-1) y tiempo de exposición (2, 4 y 6 h). Después de los tratamientos en ácido acético, la cepa parental Y8P y el clon adaptado Y8A se diluyeron en serie, y se colocaron 10 μl de cada dilución (de izquierda a derecha) en placas YPD a 28°C durante 48 horas. Figura 2. Crecimiento celular de Y8P y Y8A en medio YPD con concentraciones crecientes de ácido acético (6, 8 y 10 g/1): Control. 6 g/l de ácido acético. 8 g/l de ácido acético. 10 g/l de ácido acético. Los resultados representan los valores promedio ± SD de tres experimentos independientes. Figura 3. Porcentajes de supervivencia del Y8P y Y8A después de haber sido sometidos a diferentes condiciones de estrés. Temperatura (42°C por 2 h), etanol (10% v/v por 1 h), Sorbitol (3 M por 3 h), congelación-descongelación (dos ciclos de 24 h), oxidativo (5 mM H2O2 por 2 h), Ácido acético - HAc (5 g/1 por 6 h), ácido fórmico - Hfor (20 mM por 30 min), NaCl (1,5 M por 4 h) y ácido gálico - HGal (15 mM por 4 h). Se consideró como condición de estrés aquella que produzca una sobrevida post-estrés ≤ 60%. Cada tratamiento fue realizado por triplicado. A B C D Figura 5. Perfil de producción de bioetanol para Y8P y Y8A en diferentes concentraciones de ácido acético. Los valores son el promedio de tres experimentos independientes. Las barras representan la desviación de la media. 8 7 Y8P Y8A Control Estrés Estrés Suave Fuerte Control Estrés Estrés Suave Fuerte Control Estrés Estrés Suave Fuerte Control Estrés Estrés Suave Fuerte