Algoritmo para la identificación de bacterias patógenas en hemocultivos positivos mediante PCR en Tiempo Real LightCycler. Nele Wellinghausen et al Diagnostic.

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1 Algoritmo para la identificación de bacterias patógenas en hemocultivos positivos mediante PCR en Tiempo Real LightCycler. Nele Wellinghausen et al Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 48 (2004)

2 INTRODUCCIÓN Bacteriemia/Sepsis: rápida identificación agente causal → terapia ATB Hemocultivo: Gold Standard Incubación + tinción Gram + resiembra medios selectivos/no selectivos: 24-72h Detección rápida: ↓ uso ATB amplio espectro ↓ resistencias ↓ costes terapéuticos

3 INTRODUCCIÓN Métodos detección rápida: PCR:
Sondas DNA Sondas RNA Técnicas fluorescencia y PCR en Tiempo Real: ↑ sensibilidad y especificidad Identificación especie, género, familia, genes resistencia: Staphylococcus spp., S.aureus, gen mecA, S.epidermidis, Enterococcus spp. (faecalis/faecium), Streptococcus spp., S.agalactiae, Enterobacteriaceae, E.coli, P.aeruginosa, S.maltophilia, Acinetobacter spp., Bacteroides spp., H.influenzae, N.meningitidis. Aprox. 2-8h.

4 INTRODUCCIÓN Estudio:
PCR en Tiempo Real LightCycler: detección rápida bacterias + comunes y relevantes en hemocultivos. Identificación mediante sondas fluorescencia específicas género, familia, especie: Sondas hibridación LightCycler Sondas TaqMan

5 INTRODUCCIÓN

6 MATERIALES Y MÉTODOS Muestras: Identificación: Extracción DNA:
507 HC+ (53<18a). Julio 2001-Agosto BACTEC Positivos→Gram. Identificación: Api Strep, Api Staph, Api Coryne, Api NH, Api ANA. Morfología colonias, catalasa, MSA, Müller-Hinton, … Extracción DNA: Manual Protocolo Millar 50 con Kit MagNA Pure LC DNA. Idénticos resultados.

7 MATERIALES Y MÉTODOS Ensayos PCR:
LightCycler PCR: amplificación y detección Tiempo Real. Sondas hibridación LightCycler DNA Master Hybridation Probes Kit: Fluoresceína 3’ y Fluoróforo 5’ → Análisis curva de fusión. Amplicones regiones variables pequeñas: Sondas TaqMan, fluoresceína (FAM) 5’ y quencher (TAMRA) 3’ → No curva de fusión .

8 MATERIALES Y MÉTODOS Sondas hibridación:
LightCycler Fast-Start Master Hybridation Probes. Staph spp., S.aureus, gen mecA, S.epidermidis, Enterococcus spp., Streptococcus spp, S.agalactiae, N.meningitidis. Amplificación: Desnaturalización inicial 95ºC 10’: activar Taq-polimerasa. 50 ciclos desnaturalización 95ºC 10s, apareamiento 50-54ºC 10s Extensión 72ºC 20s Tm: Staph spp (70ºC), S.epiderm. y S.agalact. (64ºC), N.meningitidis (61ºC).

9 MATERIALES Y MÉTODOS Sondas TaqMan:
Enterobacterias, E.coli, Ps.aeruginosa, Acinetobacter spp., Bacteroides spp., S.maltophilia y H.influenzae. Amplificación: Desnaturalización inicial 95ºC 10’: activar Taq-polimerasa. 50 ciclos desnaturalización 95ºC 10s, apareamiento 59ºC (Bacteroides, Acinetob.), 61ºC (Enterob, E.coli, S.malt, H.inf, Ps.aer) 20s Extensión 72ºC 30s.

10 ANÁLISIS Sensibilidad ensayo PCR:

11 ANÁLISIS Especificidad ensayo PCR:
Investigada por panel 96 bacterias gram+ y gram- S.epidermidis PCR detectó S.lugdunensis (distinta Tm 59ºC y 64ºC) E.coli PCR detectó Shigella dysenteriae Enterobacteriaceae PCR → Chryseomonas luteola Resto PCR detectaron exclusivamente sus targets. Diagnóstico diferencial Str/Enterococo: Strep (Tm<60ºC), E.faecalis (70ºC), E.faecium/gallinarum (63ºC)

12 ALGORITMO DIAGNÓSTICO

13 ALGORITMO DIAGNÓSTICO

14 RESULTADOS Diagnóstico sensibilidad y especificidad ensayo PCR:
507 Hemocultivos: CGP: 341 (67.3%) BGN: 157 (31.0%) CGN: 1 (0.2%) CGP-BGN: 8 (1.5%)

15 RESULTADOS CGP: 341 Hemocultivos CGP:
Racimos: 269 (79.8%) Cadenas/Diplococos: 66 (19.4%) Sin identificación: 3 (0.9%) Mezcla CGP: 3 (0.9%) Muestras tratadas según algoritmo.

16 RESULTADOS

17 RESULTADOS S.epidermidis:
4 identificadas SCN no epidermidis en cultivo: 16S rDNA→S.epidermidis 1 epidermidis en cultivo/PCR (-): 16S rDNA→S.hominis 3 no identificadas por PCR: M.luteus (2), R.mucilaginosa (1) 100% concordancia especie y/o género PCR/cultivo. Test mecA PCR identificó 100%

18 RESULTADOS CGP mezclados: 15 casos:
3: CGP+BGN: BGN no detectados por PCR 7: CGP cadenas y DC: PCR identificó 6/7 6: CGP racimos + cadenas: PCR identificó Staph unicamente. 4: SAMS+S.epidermidis →2 mecA +, por S.epid MR. Conclusión: 10 casos CGP + GP/GN (no identificado).

19 RESULTADOS BGN: 157 Hemocultivos BGN:

20 RESULTADOS BGN: CGN: Concordancia PCR/cultivo casi 100%:
1 caso Chryseomonas luteola no identificada por PCR Mezclas: 7 casos 3: 2 enterobacterias: 100% concordancia 2: enterobacteria + Ps.aeruginosa: 1 falso negativo 1: Ac.lwoffli + Ac.junii: 100% 1: S.maltophilia + Ac.baumannii: no identificación S.maltophilia CGN: 1 caso: N.meningitidis PCR + → confirmado como N.meningitidis serogrupo B

21 CONCLUSIONES Rápida identificación agentes causales bacteriemia:
Set PCR-TR identificación familia, género y/o especie. Algoritmo PCR Comparación PCR/cultivo. Sensibilidad PCR: 1fg-10pg Ensayos LightCycler PCR-TR Sondas hibridación Sondas TaqMan: regiones cortas 16S rDNA gram-

22 CONCLUSIONES Algoritmo: identificación rápida y coste-efectiva
Basado en datos microscopía Permite combinar varios ensayos simultaneamente en LightCycler Efectivo Permitió detectar patógenos en solo dos rondas Alta sensibilidad/especificidad 98.3%: identificación correcta familia/género en 2 horas 7 pérdidas (1.7%): 3 CGP (M.luteus y R.mucilaginosa), 4 BGN (Agrobacterium radiobacter, Chryseomonas luteola, Fusobacterium spp, Ps.fluorescens)

23 CONCLUSIONES Mezcla: Resistencias ATB Según microscopía: 11 casos
9 bien identificados 2 pérdidas: E.coli, S.agalactiae (gran relevancia) Según cultivo (no observado en microscopio): 22 casos PCR poco sensible No se recomienda PCR para investigar infecciones mixtas Resistencias ATB Gen mecA PCR: 100% identificaciones, incluido SCN MR Test Enterococcus/Str PCR: identificó VRE

24 CONCLUSIONES Futuro: Algoritmos:
Añadir nuevos ensayos PCR detección patógenos y genes resistencia Kits comerciales preparación DNA como MagNaPure LC y controles de calidad PCR (LightCycler Hybridation Probe Master Kits) son útiles para minimizar contaminaciones. Algoritmos: Herramienta útil detección hemocultivos positivos Identificación > rápida que cultivo convencional Favorece terapia adecuada precoz antes de disponer test sensibilidad Por su complejidad técnica y alto coste, se reserva a laboratorios especializados.

25 Muchas Gracias Joaquín Granados Ortega
M.I.R. de Microbiología y Parasitología Hospital General de Castellón