UD 5 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

UD 5 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

Dot blot Souther blot Northern blot Microarrays B) MEDIO LÍQUIDO
SEGÚN MEDIO SOPORTE A) SOPORTE SÓLIDO Dot blot Souther blot Northern blot Microarrays B) MEDIO LÍQUIDO Técnica de captura de híbrido Tecnología de ADN ramificado C) IN SITU Fluorescente (FISH) Cromogénica (CISH)

A) TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SÓLIDO
La secuencia diana (habitual) o la sonda se inmovilizan sobre un soporte sólido previo a la hibridación. Diana inmovilizada: Dot blot, Southern blot y Northern blot Sonda fijada: microarrays (ác. nucleico marcado)

B) TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO
El híbrido sonda-secuencia diana se forma en solución, normalmente en pocillos de una placa microtiter, y posteriormente se fija a la pared del pocillo para su detección.

B) TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO
Habitualmente no se marca ni la sonda ni la muestra. Híbrido se detecta por métodos indirectos o menos complejos. Uso diagnóstico microbiológico y/o virus Realización similar a la de inmunoensayos tipo ELISA: Múltiples muestras simultaneamente Automatizables Las más importantes: Técnica de captura de híbrido Técnica de ADN ramificado

C) TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN IN SITU (ISH)
Permiten detectar y localizar secuencias de ácidos nucleicos (ADN y ARN) sobre cromosomas metafásicos, células y tejidos. Se realiza sobre extensiones citológicas y secciones de tejido. Dependiendo del marcador empleado: Hibridación in situ fluorescente (FISH): sondas marcadas con fluorocromos y microscopio de fluorescencia Hibridación in situ cromogénica: (CISH): sondas marcadas con haptenos. Los híbridos se detectan por métodos inmunohistoquímicos (reacción coloreada visible con microscopio óptico) Ambas se han automatizado

AMPLIFICACIÓN DEL ONCOGÉN HER2 EN CÁNCER DE MAMA
Figura 1. A. Técnica Dual ISH, se observa de forma clara la morfología del área infiltrante en este carcinoma ductal. Se reconoce el centrómero del cromosoma 17 (rojo-cromógeno) y el gen HER2 (negro-plata) en los núcleos neoplásicos. B.

HIBRIDACIÓN SIN ELECTROFORESIS NI DIGESTIÓN ENZIMÁTICA DOT BLOT
Transferencia a la membrana directamente. Indica presencia o ausencia de una secuencia CON ELECTROFORESIS Y DIGESTIÓN E. (separar ac. nucleicos) antes de la transferencia SOUTHERN BLOT: ADN NORTHERN BLOT: ARN HIBRIDACIÓN IN SITU: los ác. nucleicos se mantienen en su lugar de origen

CONCEPTOS BÁSICOS BLOTTING = Transferencia de proteinas o ácido nucleico de un gel a una membrana. Si se trata de ADN, la técnica se llama SOUTHERN BLOT. Una vez transferido, se utilizan sondas de ADN (moléculas de ADN marcadas) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda. Si se trata de ARN, la técnica se llama NORTHERN BLOT. Se utilizan sondas ADN marcadas Si se trata de proteínas, la técnica se llama WESTERN BLOT. Las proteínas se separan electroforéticamente en un gel de poliacrilamida y posteriormente utilizando un campo eléctrico perpendicular al gel se transfieren a una membrana. Esta membrana se hibrida con Ac específico.

A) SOPORTE SÓLIDO 5.2. DOT BLOT/SLOT BLOT

DOT BLOT(punto)/SLOT BLOT(hendidura) Complementario
Utilizada para detectar biomoléculas. La muestra de AND o ARN se inmoviliza directamente en la membrana sin digestión enzimática previa. Las moléculas a detectar no necesitan ser separadas por electroforesis previamente como ocurre en el Northern, Southern o western blot. Se aplican directamente en una membrana en forma de gota (dot) o línea (slot). Posteriormente se hace reaccionar con sondas. Es mucho más rápida que las anteriores, sin embargo, no da información del tamaño de la muestra a determinar. Por lo tanto esta técnica sólo sirve para confirmar la presencia o ausencia de una biomolécula/s detectables mediante sondas de DNA o anticuerpos

DOT- PUNTO

SLOT-HENDIDURA

5.2. DOT BLOT/SLOT BLOT Técnica de hibridación simple que utiliza membranas de nitrocelulosa o nailon como soporte sólido, que permite detectar secuencias de ác. nucleícos (ADN y ARN). Forma más simple de hibridación. Dot: forma circular/ slot: forma de banda Sobre las membranas se coloca una gota de la muestra (ac. nucleico purificado, lisado celular, amplificado de PCR, etc) usándose sondas radioactivas o marcadas con haptenos. Permite estudio simultáneo de varias muestras Incuban las membranas con reactivos: Inmersión en cubetas Bolsas de plástico termosellables o de cierre hermético Frascos con tapón de rosca

PROTOCOLO GENÉRICO DOT BLOT
PREHIBRIDACIÓN HIBRIDACIÓN LAVADO POSTHIBRIDACIÓN DETECCIÓN DEL HÍBRIDO

PROTOCOLO GENÉRICO DOT BLOT
A) APLICACIÓN DE LA MUESTRA AL SOPORTE Humedecer la membrana: 10 min en tampón o agua destilada Retirar el exceso de líquido colocando la membrana entre dos hojas de papel de filtro Ensamblar la membrana en el sistema de vacío. plantilla con pocillos numerados (debajo de esta la membrana) Junta selladora para evitar contaminación cruzada entre muestras Sobre cámara colectora conectada a vacío Proceso varía para ADN y ARN.

1. Aplicación de las muestras de ADN
ADN desnaturalizado : Na(OH) 0,4 M y EDTA a una concentración final de 10 mM, 100ºC-10 min. Neutralizar con un volumen igual de acetato de amonio (CH3COONH4) 2M a ph 7 Cargar y aplicar el vacío. El ADN de la muestra se queda retenido en la embrana y el resto de reactivos se filtran a la cámara colectora. Lavar cada muestra(pocillo) Na(OH) 0,4 M o SSC (buffer de cloruro sódico+citrato de sodio) 2x y fltrar a vacío Desmontar, lavar memmbrana con SSC 2x y secar en estufa a 80ºC durante min. Alternativamente las muestras sobre membranas de nailon pueden ser ancladas mediante irradiación con luz ultravioleta. La unión ADN-membrana se realiza por el esqueleto azúcar-fosfato y las bases quedan libres para hibridar con la sonda.

2. Aplicación de las muestras de ARN
Desnaturalizar (evitar horquillas intracatenarias): NaOH 10mM y EDTA 1 mM Lavado con la misma solución Extraida la membrana del sistema de vacío lavar con SSC 2x, 0,1% de SDS. Las membranas de nitrocelulosa se secan a 80ºC y las de nailon en la estufa o se irradian con UV.

B) PREHIBRIDACIÓN Membranas con las muestras se incuban con solución prehibridación para evitar uniones inespecíficas de la sonda a la membrana (disminuir ruido de fondo) Solucíon prehibridación = composición que las de hibridación pero sin sonda. Pueden llevar ADN carrier (ADN esperma de salmón) para bloquear las uniones inespecíficas. Membrana se incuba en esta solución a 65-68ºC y a 42ºC si se utiliza formamida. Tiempo variable dependiendo del protocolo, desde min a horas.

C) HIBRIDACIÓN Sondas de ADN bicatenario se desnaturalizan antes de su uso, ºC durante 5 min y enfriamiento rápido en hielo. Se retira la solución de prehibridación y se sustituye por un mismo volumen de igual solución freca añadiéndole la sonda recién desnaturalizada. La membrana se incuba a temperatura adecuada, en agitación, durante 4-24 horas.

D) LAVADO DE POSTHIBRIDACIÓN
Bolsa: se saca la membrana de la bolsa y se coloca en una cubeta para los lavados en agitación. Habitual: 2-3 lavados disminuyendo la fuerza iónica (aumentando la rigurosidad) SSC 2x – SSC 0,5x – SSC 0,1x o aumentando la temperatura L

E) DETECCIÓN DEL HÍBRIDO
E.1. Marcado radiactivo Finalizado el último lavado la embrana se seca y revela mediante exposición autoradiográfica, colocando una placa radiográfica encima y manteniendo el conjunto en oscuridad durante horas-días. Muestras + = puntos negros. Contienen la secuencia diana. Si a la membrana se le realiza una 2ª hibridación (rehibridación) es importante no dejarla secar. La membrana se envuelve en plástico para mantenerla y se evita el contacto con la placa fotográfica.

E) DETECCIÓN DEL HÍBRIDO
E.2. Marcado con haptenos Finalizado el lavado se revela con un método de detección cromogénico (CISH). Muestras + = mancha coloreada Tras una detección cromogénica no pueden usarse para una 2ª hibridación, puesto que los compuestos coloreados son insolubles, precipitan y tiñen la membrana de manera indeleble.

F) REHIBRIDACIÓN Con sondas radioactivas.
Desnaturalizar los híbridos formados y eliminar la sonda utilizada. Membrana siempre húmeda y no se seque durante la autoradiografía. Despegar la 1ª sonda: 2 lavados 20 min con una solución de baja fuerza iónica (SSC 0,1x) y con detergente (SDS 0,5x) y a Tra 95ºC Para comrobar el lavado efectivo se expone una nueva placa toda la noche, se revela y se comprueba que la placa está limpia. A continuación se inicia nuevamente el protocolo de hibridación a partir de la prehibridación.

5.2.2.APLICACIONES DOT BLOT COMO TÉCNICA DE RASTREO-SCREENING
Estudios de expresión génica, detectar ARNm concretos en poblaciones celulares en situación basal y tras distintas estimulaciones, en células tumorales, etc. Detección de secuencias extrañas en muestras biológicas: presencia de virus, bacterias o parásitos. Control de calidad de PCR para comprobar la especificidad de los productos amplificados (confirmación de casos dudosos) Control de calidad del marcaje de sondas, utilizando como muestra secuencias diana control. Permite calular la sensibilidad y el límite de detección de la sonda marcada. Determinación del sexo en especies sin diferencias fenotípicas.

5.2.2.APLICACIONES DOT BLOT APLICACIONES ESPECÍFICAS-ASO dot blot
Detectar mutaciones en homocigosis y heterocigosis, mediante el empleo de oligonucleótidos específicos de alelo. Detectar mutaciones asociadas con enfermedad y siempre que el número de posibles variantes alélicas relevantes sea reducido (ejemplo anemia falciforme) 1º PCR para amplificar la región del gen que presenta variaciones alélicas. El producto de la PCR es la muestra en el dot blot y se hibrida con oligonucleótidos específicos del alelo normal(no mutado) y de cada variante alélica.

5.2.2.APLICACIONES DOT BLOT APLICACIONES ESPECÍFICAS- dot blot inverso o reverse Mismo fundamento que el ASO dot blot pero con una estrategia inversa. En la membrana se inmoviliza los oligonucleótidos específicos de alelo (normales y mutados) sin marcar, lo que permite estudiar genes con un gran número de variantes alélicas que afectan a distintas zonas del gen. Se marca el producto de PCR, utilizando nucleótidos marcados en la PCR o usando cebadores marcados. Para cada caso se emplea una membrana que se hibrida con el producto de PCR marcado. Permite distinguir entre homocigotos y heterocigotos. Estudio talasemias.

5.2.2.APLICACIONES DOT BLOT APLICACIONES ESPECÍFICAS- hibridación de colonias Detectar bacterias que portan una secuencia génica concreta, un gen de interés, un plásmido natural o uno recombinante. Placa de cultivo crecida, con colonias bacterianas aisladas. Se recorta una membrana para dot blot y se coloca sobre las colonias para hacer una impronta. Se lisan las bacterias y se desnaturaliza el ADN (membrana en papeles secantes y empapados con SDS 10% Y NaOH 0,5N). Fijar el ADN al soporte mediante calor o UV y se continúa con el dot blot tradicional. Tras el revelado: mancha oscura en la posición de la membrana que contactó con una colonia que portaba la secuencia diana.

5.2.2.APLICACIONES DOT BLOT APLICACIONES ESPECÍFICAS- hibridación de placas virales-plaque lift Detectar virus. Útil en tecnología de ADN recombinante. Similar a la hibridación de colonias, pero lo que se replica sobre la membrana de dot blot es la distribución de placas virales de lisis producidas por los fagos sobre un césped de bacterias crecido en una placa de cultivo.

A) SOPORTE SÓLIDO 5.3. SOUTHER BLOT

SOUTHER BLOT (complementario)
Someter a los fragmentos de ADN obtenidos por una enzima de restricción, a una electroforesis en gel de agarosa. El ADN que está en el gel de agarosa debe transferirse a un filtro o membrana de nitocelulosa (blotting) porque estas son mas manejables y estables que el gel. Posteriormente se hibrida con secuencias complementarias de ADN, marcadas con sustancias radioactivas, enzimas o fluorocromos. Se harán visibles con autorradiografía, el sustrato del enzima o por iluminación con UV respectivamente. Las secuencias complementarias de ADN marcadas se denominan sondas.

Tras separar las bandas de ADN por electroforesis se realiza una desnaturalización con álcalis y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa. SOUTHER BLOT Así se realiza en el laboratorio

SOUTHER BLOT En la membrana las moléculas podrán ser analizadas por técnicas de hibridación utilizando sondas marcadas con fluorocromos, radiactividad, enzimas o iones metálicos. Así se realiza en el laboratorio

RESUMEN SOUTHER BLOT Aislar ADN Cortar ADN Enzima restricción
Electroforesis Separa por tamaño Desnaturalizar ADN (calor o químicos) romper doble cadena Transferir ADN del gel a nitrocelulosa Hibrida con sonda marcada

5.3. SOUTHER BLOT Permite identificar fragmentos de ADN separados por electroforesis en gel y transferidos a una membrana de nitrocelulosa o nailon. A diferencia del dot blot, permite la detección simultánea de varias secuencias diana de distintos tamaños con una única hibridación. Normalmente se utilizan sondas radiactivas (existen otros marcajes) PROTOCOLO Digestión enzimática Electroforesis en gel Transferencia del ADN a la membrana Hibridación Revelado

5.3.1. PROTOCOLO DEL SOUTHER BLOT
DIGESTIÓN ENZIMÁTICA Con una o varias enzimas de restricción se fragmenta el ADN. Cuando se trabaja con ADN genómico es preferible digerir toda la noche con un exceso de enzima. Digerir un plásmido clonado suficiente incubación 1-2 horas.

ELECTROFORESIS EN GEL (agarosa o poliacrilamida) En el gel se puede incorporar un intercalante fluorescente(bromuro de etidio) y tras electroforesis iluminarlo con UV mediante transiluminador y fotografiarlo. O bien teñir el gel con el agente intercalante después de la electroforesis y obtener la fotografía. La fotografía permite comparar el patrón de bandas de ADN. En una de las posiciones del gel se coloca un marcador de tamalos como referencia. ADN genómico: tras la electroforesis se observa una estela fluorescente (smear) porque la digestión produce un número elevado de fragmentos de diferentes tamaños. Plásmidos: patrones con un número reducido de bandas.

TRANSFERENCIA DEL ADN A LA MEMBRANA Consta de varios pasos: Desnaturalización ADN para que posteriormente se produzca la hibridación. Desnaturalización alcalina (NaOH) Neutralización con un tampón de ph neutro Lavado del gel con solución de lavado (solución salina fosfato con EDTA, SSPE 20x)

TRANSFERENCIA DEL ADN A LA MEMBRANA Transferencia por capilaridad. Cubeta con el buffer de transferencia (SSPE 10x) Soporte plástico en el interior de la cubeta que sobresalga del buffer de transferencia. Papel whatman humedecido con buffer de transferencia y con sus extremos en el buffer de la cubeta. El gel colocado cara abajo. Membrana previamente humedecida Tres hojas de papel whatman Una pila de papeles absorbentes Un peso ligero (placa de cristal). Este dispositivo se mantiene toda la noche. El paso del buffer por capilaridad desde la cubeta hasta la pila de papeles movilizando los fragmentos de ADN en el sentido del flujo, pasando del gel a la membrana.

TRANSFERENCIA DEL ADN A LA MEMBRANA 3. Anclaje del ADN a la membrana: incubando la membrana en estufa a 80ºC o con UV las membranas de nailon. Hibridación De manera similar a la del dot blot (membrana+reactivos dentro de una bolsa con cierre hermético o acoplada a la pared interna de un tubo de hibridación) En agitación y tra adecuada. Previa a la hibridación la embrana se incuba con una solución prehibridación con ADN de esperma de salmón desnaturalizado para bloquear uniones inespecíficas. Sonda o sondas (Tm similares) específicas marcadas (secuencias diana situarse en fragmentos de distinto tamaño para localizarlas de manera independiente. 2 o + lavados posthibridación (6x,2x,1x)

REVELADO Autoradiografía con una película de rayos x Posibilita la identficación de la secuencia diana en un fragmento de tamaño específico.

5.3.2. APLICACIONES DEL SOUTHERN BLOT
Muchas aplicaciones están siendo sustituidas por técnicas como la PCR. Elaboración de huellas genéticas Estudio de mutaciones estructurales (traslocaciones, deleciones, inserciones, inversiones) Detección de secuencias adquiridas.

A) SOPORTE SÓLIDO 5.3. NORTHERN BLOT

NORTHERN BLOT (Complementario)
Detectar ARN ( no necesita desnaturalización = ARN 1 cadena) utilizando una sonda de ADN marcada con fluorocromos, radiactividad, enzimas o iones metálicos.

5.4. NORTHERN BLOT Permite detectar moléculas de ARN separadas por electroforesis en gel y transferidas a una membrana de nitrocelulosa o nailon.

5.4.1. PROTOCOLO DEL NORTHERN BLOT
DIFERENCIAS CON EL SOUTHER BLOT No digestión enzimática Electroforesis en condiciones desnaturalizantes Geles de agarosa con formaldehído Muestra de ARN se diluye en un tampón con formamida y formaldehído y se calienta a 65ºC No es necesario el paso de desnaturalización antes de la transferencia del gel a la membrana. La transferencia del ARN del gel a la membrana, la hibridación y el revelado se realizan de forma similar a como se ha descrito en la técnica anterior.

5.4.2. APLICACIONES DEL NORTHERN BLOT
Análisis de expresión génica La detección de mutaciones Estudios de corte y empalme o splicing alternativos.

A) SOPORTE SÓLIDO 5.3. MICROARRAYS

MICROARRAYS o CHIPS ADN I(Complementario)
Un Chip de ADN o un ADN microarray es una pieza de vidrio o plástico al que se ha fijado miles de fragmentos de ADN formando una disposición ordenada microscópica. El principio en que se basa es en la hibridación de las secuencias complementarias de ADN Los microarrays permiten estudiar en una muestra biológica la presencia de miles de secuencias al mismo tiempo. Segmentos de DNA de genes conocidos se sitúan en una superficie sólida (Pueden colocarse miles de puntos en un microarray de varios cm2 ) Una vez que el DNA está ligado a la superficie. El microarray puede ser ensayado con sondas marcadas por fluorescencia La intensidad de la fluorescencia indica el nivel de expresión del gen ensayado

Se pueden utilizar como sonda ADNc obtenido de distintos tipos celulares o
conseguido mediante distintas condiciones experimentales. Los microarrays son analizados con un escáner e interpretados con software específico.

MICROARRAYS o CHIPS ADN

8.-MICROARRAYS o CHIPS ADN

MICROARRAYS o CHIPS ADN
EXPRESION GENETICA ANTE SUSTANCIAS TOXICAS DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES ESTUDIO DE ENFERMEDADES GENETICAS COMPLEJAS FISIOLOGIA CELULAR DETECTAR POLIMORFISMOS Y MUTACIONES COMPORTAMIENTO DE LA CELULA ANTE FARMACOS ESTUDIO DE LA EXPRESION GENETICA EN EL DESARROLLO… Fijación al soporte de las moléculas de ADN

5.5. MICROARRAYS Conjuntos o colecciones de fragmentos de ADN (sondas) distintos fijados a una superficie sólida (vidrio, plástico o silicio). Un microarray detecta simultáneamente miles de secuencias distintas, cualitativa y cuantitativamente. Aporta mucha información en una única reacción. Potente herramienta para estudios genómicos y de expresión génica. Sondas monocatenarias no marcadas ancladas en el biochip. Se marca con fluorocromos la muestra a estudiar. Lectura se realiza con escáner (tecnología láser) de lectura tras hibridación.

5.5.1. FABRICACIÓN DE MICROARRAYS
Se siguen dos estrategias: Depositar las sondas, una a una, en posiciones determinadas del soporte sólido. Sondas: fragmentos ADNc, oligonucleótidos sintéticos específicos o productor de ampliación de PCR con un único primer. Depósito de las sondas sobre el soporte se realiza mediante un brazo robotizado con una matriz de finas agujas que se sumergen en las sondas y depositan microgotas, en posiciones concretas del soporte sólido. Resultado: microarrays con decenas de miles de puntos(sondas) microscópicas en una superficie de 2-3 cm2 Sintetizar las sondas sobre la propia superficie sólida. Sondas= pequeños oligonucleótidos (25 bases) que se sintetizan in situ en una localización concreta mediante técnicas fotolitográficas o electroquímicas. Matrices con cientos de miles de sondas en una superficie de -2 cm2.

5.5.2. PROTOCOLO DE TRABAJO GENÉRICO
Varían según el fabricante y la muestra pero tienen pasos comunes: Marcaje de la muestra: Estudios de expresión génica: purificar ARNm y sintetizar ADNc con nucleótidos marcados. Algunos fabricantes recomiendan obtener ADNc sin marcar y hacer una transcripción in vitro de él empleando nucleótidos marcados con biotina. Estudios genómicos: purificar ADN y se marca, por ejemplo, mediante nick translation o random priming. Hibridación y lavados poshibridación: Marcaje con biotina, tras lavado paso extra de tinción, consistente en incubar el microarray con estreptavidina marcada con fluorocromo. Lectura del microarray: escáner que dispone de un láser que excita cada punto de la matriz con la longitud de onda adecuada al fluorocromo utilizado y de un detector que mide la intensidad de la fluorescencia. Análisis e interpretación de los resultados: software específico

5.5.3. APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS
HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARADA EN ARRAYS (Acgh) Permite detectar e identificar alteraciones genéticas consistentes en pérdida(delecciones y microdelecciones) o ganancia(duplicaciones y microduplicaciones) de material genético, mediante la comparación del ADN de una muestra con un ADN de referencia. ADN muestra y ADN referencia con fluorocromos distintos (verde y rojo). Se mezclan en la misma proporción y se hibrida con un array fabricado de ADN clonado, ADNc u oligonucleótidos. Ambos ADN compiten por hibridar. Puntos rojos: delecciones ADN problema Puntos amarillos: genes inalterados Puntos verdosos: duplicaciones ADN problema

HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARADA EN ARRAYS (Acgh) 1 array=múltiples genes con múltiples sondas de distintas regiones del gen. Alta sensibilidad (microdelecciones y microduplicaciones) Células tumorales, diagnóstico enfermedades genéticas y diagnóstico prenatal. Limitación: no detecta alteraciones cromosómicas estructurales (traslocaciones o inversiones) puesto que las secuencias diana están presentes en cantidades normales aunque se sitúen en localizaciones cromosómicas anómalas.

ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA. Pueden realizarse: Términos absolutos: hibridando el microarray con ADNc. Se puede saber que genes se expresan y con qué intensidad. Términos comparativos: hibridando el microarray con una mezcla del ADNc de la muestra problema y un ADNc de referencia maracados con distintos fluorocromos. El color dependerá de las proporciones de un ADNc concreto. Los estudios de expresión génica comparada permiten comparar la misma población celular endistintos estadíos metabólicos o en distintas situaciones. Ütil: efectos medicamentos, respuestas antes agentes físicos, químicos o infecciosos.

OTRAS APLICACIONES Estudio polimorfismos y mutaciones, con gran repercusión en el diagnóstico, pronóstico y evolución de enfermedades, así como la predisposición a padecerlas. Detección de microorganismos contaminantes en alimentos y muestras biológicas, el estudio e splicing alternativos del ARN, genes de fusión, etc.

5.6. TÉCNICA DE CAPTURA DE HÍBRIDO
B) MEDIO LÍQUIDO 5.6. TÉCNICA DE CAPTURA DE HÍBRIDO

CAPTURA HÍBRIDA (Complementario)
Consiste en hibridar el DNA de la muestra con una sonda de RNA. El híbrido ARN-ADN se captura en con un Ac anti-híbrido adherido a las paredes de un pocillo. El Ag (híbrido ADN muestra-ARN sonda se detecta inmunológicamente mediante luminiscencia p.e.

5.6. TÉCNICA DE CAPTURA DE HÍBRIDO
Formación de híbridos ARN/ADN que serán reconocidos o capturados por anticuerpos específicos. Si la secuencia diana es ADN, la sonda será ARN y viceversa. La “captura” del híbrido se produce mediante anticuerpos específicos que se hallan fijados en las paredes de los pocillos (placa microtiter) –VPH. Pasos a seguir: Lisis de los virus y desnaturalización del ADN. Tubo eppendorf =muestra + solución alcalina desnaturalizante Hibridación: tubo limpio=muestra desnaturalizada+sonda Captura del híbrido: mezcla de hibridación se pasa pocillo placa microtiter (recubierta de anticuerpos anti-ARN/ADN) Detección híbrido: añaden al pocillo anticuerpos anti-ARN/ADN marcados con fosfatasa alcalina y también se unen al híbrido Revelado: añadir sustrato quimioluminiscente. Luminómetro o lector de placas.

5.7. TECNOLOGÍA DEL ADN RAMIFICADO
B) MEDIO LÍQUIDO 5.7. TECNOLOGÍA DEL ADN RAMIFICADO

5.7. TÉCNOLOGÍA DEL ADN RAMIFICADO
bDNA (branched DNA): + sensibilidad captura de híbrido Cuantificación de cargas virales en muestras biológicas. Pasos: 1- Lisis de las partículas víricas y desnaturalización (virus ADN) 2- Hibridación con sondas específicas: Sondas para captura: una parte de la sonda complementaria al ac. Nucleico vírico y la otra al oligonucleótido de captura fijado en la pared del pocillo de una placa microtiter. Sondas de extensión: una parte complementaria al virus y la otra a un oligonucleótido preamplificador que se utiliza en un paso posterior. Hibridación en un tubo en condiciones de elevada rigurosidad.

3- Captura del híbrido: la mezcla de hibridación se traspasa a un pocillo de una placa microtiter (oligonucleótido de captura). Al hibridar el ác. Nucleico vírico queda anclado a la pared del pocillo. 4- Preamplificación: se añade al pocillo un oligonucleótido preamplificador, que tiene en un extremo una secuencia complementaria de la región no apareada de la sonda de extensión, que está unida al ác.nucleioco vírico. Tras hibridación el preamplificador va a constituir el “tronco” del sistema de amplificación de señal. El resto del oligonucleótido contiene numerosas secuencias cortas repetidas, complementarias de los extremos de los llamados oligonucleótidos amplificadores

5- Amplificación: añaden los amplificadores que se unen a las secuencias repetidas del o. preamplificador, constituyendo las ramas del sistema de amplificador de señal. Los amplificadores tienen múltiples secuencias repetidas complementarias de pequeños o. marcados con fosfatasa alcalina. 6- Detección: añaden los o. marcados con fosfatasa alcalina que se unen a los amplificadores, constituyendo las hojas del sistema de amplificación. 7- Revelado: se añade el sustrato quimioluminiscente. Se detecta mediante luminómetro o lector de placas.

5.8. ISH. TIPOS DE MUESTRAS. Hibridación In situ: la secuencia diana se localiza en el sitio que se encuentra fisiológicamente (ADN=cromosomas o núcleos interfásicos /ARN=citoplasma) Se colocan estructuras celulares o tisulares en monocapa sobre portaobjetos. El ISH se puede realizar sobre preparaciones citogenéticas de metafases o núcleos interfásicos desnudos, extensiones citológicas y secciones de tejido.

HIBRIDACIÓN IN SITU (ISH)- Complementario
Es la identificación del DNA o RNA en células o cromosomas. Es una técnica que tiene como ventaja que la hibridación la vemos donde está y sabemos cómo está, pudiendo analizar genes en cortes de tejidos, extensiones celulares o en los propios cromosomas. Consiste en la fijación de sondas de DNA o RNA, previamente marcadas, a ácidos nucleicos diana (muestra).

HIBRIDACIÓN IN SITU (ISH)
No es una técnica de uso general. Aporta una información sobre la fisiología de las células y los tejidos que no es posible obtener con otras técnicas. Se usa ampliamente en investigación en desarrollo embrionario, diferenciación de células madre, manipulaciones genéticas o cambios en la fisiología celular frente a señales externas, entre otras. Permite descubrir la expresión de un gen mediante la detección de su producto, el ARN mensajero. Podemos descubrir qué células expresan un gen determinado y cuándo lo expresan. La expresión génica es un testimonio directo de la funcionalidad celular. Existe otra aplicación de la hibridación y consiste en la localización física de un gen sobre un cromosoma.

REACTIVOS NECESARIOS: DIANA → Es el ácido nucleico que contiene la secuencia genómica que se pretende detectar (está en la muestra). SONDA → Son oligonucleótidos, compuestos de 15 a 100 nucleótidos, que son capaces de fijarse, de una forma complementaria, a secuencias genómicas específicas del ácido nucleico diana ( no son compartidas por otros ácidos nucleicos). SISTEMA INDICADOR → Es el mecanismo mediante el cual se marca a la sonda para su ulterior detección. Este sistema puede ser: Isótopo radiactivo. Biotina: puede detectarse con avidina o estreptavidina (es el sistema indicador más usado en A.P.) Enzima: unida al ácido nucleico. Dotar al ácido nucleicos de capacidad antigénica y usar AC monoclonales marcados. Digoxigenina (hapteno) Fluorocromos.

HIBRIDACIÓN IN SITU (ISH). Descripción:
Si el ADN es bicatenario, se desnaturaliza, mediante calor, para separar sus dos cadenas (94-96 ºC) Se ponen en contacto la sonda marcada y las cadenas de ácido nucleico. Se baja la temperatura para permitir que la sonda reconozca a algunas de las secuencias genómicas de los ácidos nucleicos e hibride con ella (40-65 º C) El conjunto formado por la cadena de ácido nucleico y la sonda, es detectado por un método apropiado al sistema indicador. Existe un aparato, llamado CÁMARA DE HIBRIDACIÓN, que hace posible aplicar las temperaturas necesarias en esta técnica. Hibridación in situ de CIN (neoplasia intraepitelial) con Papilomavirus positivo

AP se utiliza para cortes o extensiones celulares, siendo el método más utilizado el marcaje con sondas biotinadas, procediendo después al revelado semejante al realizado en inmunohistoquímica, por tanto tenemos dos métodos: M. DIRECTO: Tenemos una monocadena de DNA y añadimos una sonda biotinada, que se une a la fracción complementaria de ADN, posteriormente añadimos estreptavidina marcada con un enzima (peroxidasa +H2O2+DAB o fosfatasa alcalina). M. INDIRECTO: Se añade la sonda biotinada y un anticuerpo antibiotina (Link 1 = Ac 1º). A continuación se le añade un Ac frente al Ac primario (Link 2 = Ac 2º), este está asociado al complejo Biotina-Streptavidina marcada con una enzima. A continuación se procede al revelado según la enzima empleada.

5.8.2. PREPARACIONES DE NÚCLEOS INTERFÁSICOS DESNUDOS
Núcleos en interfase sobre los que realizar la hibridación. A partir de sangre periférica o médula ósea. Pasos: 1- Choque hipotónico: muestra + solución hipotónica de KCl (0,075M) proporción 1:5 y se incuba a 37ºC durante 20 min. 2- Fijación: solución de Carnoy (metanol+ac.acético glacial 3:1). Hematíes se lisan y los leucocitos se “endurecen”. Una suspensión de leucocitos en Carnoy -20ºC consevarse 1 año. 3- Extensión de los núcleos: sobre portaobjetos desengrasados y fríos. Pipeta pasteur con células en carnoy y dejar caergotas sobre el porta a una distancia de 30 cm. Al chocar las células fijadas con el porta frío se rompen y los núcleos desnudos se pegan. Se seca y se hibrida o se conservan -20ºC

5.8.3. EXTENSIONES CITOLÓGICAS
A partir de fluidos biológicos con células en suspensión: manual o automatizado. La extensión se seca y se somete a fijación suave (etanol 4ºC, metanol/acetona al 50% a 4ºC o paraformaldehído al 4%)

SECCIONES DE TEJIDO. Tejido conservado mediante congelación mediante criostato. Sobre un porta y se fijan por inmersión en etanol a 4ºC Tejido fijación en formol e inclusión en parafina. Secciones 3-4 micras) mediante microtomo, se recogen con pincel fino, se deposita sobre baño de flotación (40ºC) para que se extiendan y se pescan con un portaobjetos

SECCIONES DE TEJIDO. Portaobjetos tratados para evitar pérdida de la muestra: Recubrimiento con adhesivos especiales. Albúmina no porque es digerida por las proteasas empleadas en la técnica. Mejor la polilisina y derivados de organosilano que no son atacadas por las enzimas. Inmersión de los portas en una solución del adhesivo, se dejan secar en posición vertical y se almacenan en congelador -20ºC Portaobjetos cargados positivamente. Retienen las secciones del tejido por uniones electroestáticas (fijador formaol=tejidos carga negativa). Tras colocar las secciones incubarlas en estufa 55ºC un mínimo de 2 horas para conseguir buena adherencia.

5.9. ISH FLUORESCENTE (FISH)
Usa sondas marcadas con fluorocromos (microscopio fluorescencia) FISH metafásica: cromosomas metafásicos FISH interfásica: núcleos interfásicos desnudos FISH sobre tejido congelado. Aplicación: detección alteraciones cromosómicas numéricas(monosomías, trisomías, poliploidías) y estructurales(traslocaciones, delecciones, inserciones, inversiones y duplicaciones) en relación con patologías oncológicas o con base genética. Complementa los resultados de cariotipos.

PROTOCOLO GENÉRICO Es la más sencilla y rápida de las técnicas de hibridación. FASES: HIBRIDACIÓN LAVADO DE POSTHIBRIDACIÓN CONTRATINCIÓN VISUALIZACIÓN En FISH sobre secciones de tejido, el protocolo es más laborioso, puesto que hay que permeabilizar el tejido con un tratamiento enzimático para que las sondas accedan bien a las secuencias diana (CISH)

5.9.1. PROTOCOLO GENÉRICO HIBRIDACIÓN
Se realiza sobre la preparación, aplicando 5 µl de la sonda marcada en el área de hibridación y colocando encima un cubreobjetos, evitando la formación de burbujas. Portaobjetos sobre placa calefactora a 72ºC durante 4-5 minutos para desnaturalizar el ADN de la muestra y la sonda (sonda de ADN bicatenario) Portaobjetos en cámara húmeda para evitar desecación y se incuba (37-42ºC) durante horas para que se de la hibridación.

5.9.1. PROTOCOLO GENÉRICO LAVADO DE POSTHIBRIDACIÓN
Lavado o lavados por inmersión de los portas en soluciones de lavado colocadas en cubetas Coplin, una vez retirados los cubreobjetos. En este lavado se fijan las condiciones de rigurosidad. CONTRATINCIÓN Porta en posición vertical sobre papel de filtro. 5-7 µl de solución de contratinción (diamino-fenil-indol- DAPI-fluorescencia) sobre el área de hibridación Coloca cubreobjetos sin hacer burbujas Núcleos fluorescencia azul con microscopio de fluorescencia Conservarse en nevera 2-8ºC preservados de la luz

5.9.1. PROTOCOLO GENÉRICO VISUALIZACIÓN
M. fluorescencia con flitros adecuados a los fluorocromos de las sondas (verde y rojo) Preparaciones en metafase: cromosomas en color azul y las regiones con secuencias diana como puntos o manchas rojas o verdes. Núcleos desnudos: color azul con puntos verdes o rojos Analizar mínimo 200 núcleos y el resultado se expresa como porcentaje de núcleos que presentan la alteración que se estudia. Interpretación depende de la sonda usada y de la alteración cromosómica que se estudie.

FISH EN METAFASE FISH EN INTERFASE
La técnica de FISH también se puede utilizar sobre células en interfase, para determinar el número de copias de uno o varios cromosomas. La ventaja principal de la FISH en interfase es que se puede realizar muy rápidamente, normalmente en 24 horas, porque no requiere crecimiento de las células en el laboratorio. La técnica de FISH puede usarse sobre células en metafase para detectar microdelecciones específicas más allá de la resolución de la citogenética convencional o para identificar material genético extra de origen no conocido.

FISH INTERFÁSICA Detección de secuencias de ADN en núcleos en interfase, sobre preparaciones citogenéticas de núcleos desnudos o en extensiones citológicas o secciones de tejido. Las sondas empleadas se diseñan de manera específica según la anomalía cromosómica que se quiere detectar: numérica o estructural. En estudios citogenéticos en humanos, las más utilizadas son: centroméricas Específicas de locus

5.9.2. FISH INTERFÁSICA SONDAS CENTROMÉRICAS.
Las sondas centroméricas o sondas CEP (chromosome enumeration probes) hibridan con secuencias localizadas en el centrómero de cromosomas concretos. Existen sondas centroméricas para cada cromosoma: CEPx, siendo x el número de cromosoma. Se emplean en el estudio de anomalías cromosómicas numéricas: aneuploidías y poliploidías. En el núcleo interfásico se observará se observará un punto fluorescente por cada cromosoma igual presente en él. Para diferencias una trisomía de una poliploidía, la hibridación se realiza con un cóctel de al menos dos sondas CEP, una específica del cromosoma de interés, y otra específica de un cromosoma control. Ejemplo: si marcamos en verde la del cromosoma de interés y en roja la del cromosoma control. En una trisomía se observarán tres puntos verdes y dos rojos y en una triploidía tres puntos verdes y tres rojos.

5.9.2. FISH INTERFÁSICA SONDAS ESPECÍFICAS DE LOCUS.
Las sondas específicas de locus o sondas LSI (locus specific identifier) hibridan en locus (regiones) concretas de un cromosoma, implicadas en patologías específicas. Útiles en anomalías numéricas y sobre todo en las estructurales ( traslocaciones, microdeleciones y microamplificaciones. Para la identificación de traslocaciones se han desarrollados dos estrategias, basadas en juegos de sondas (de separación o de fusión) que hibridan a ambos lados de los puntos o regiones en que se producen las roturas de los cromosomas: Sondas de separación ( sondas Split o break-apart): se emplean para detectar traslocaciones en las que uno de los cromosomas implicados es siempre el mismo, pero el otro puede variar. La hibridación se realiza con un juego de dos sondas marcadas en verde y rojo que hibridan a ambos lados del punto de rotura en el cromosoma que está siempre implicado en la traslocación.

FISH INTERFÁSICA Cuando no existe traslocación, al hibridar tan próximas las sondas, las fluorescencias de ambas se superponen y se observan solo dos puntos amarillos ( mezcla de rojo y verde) o dos pares de puntos rojos y verdes superpuestos con una zona amarilla central. Si existe traslocación, se observan tres puntos fluorescentes: uno amarillo, correspondiente al cromosoma intacto, y uno rojo y otro verde separados, correspondientes a las dos partes del cromosoma traslocado. Sondas de fusión: Se emplean para detectar traslocaciones en las que se conocen los dos cromosomas implicados ( pej. Traslocación t(11;14) asociada al linfoma del manto. En este caso se utilizan dos pares de sondas. Cada par de sondas va a hibridar a ambos lados de los puntos de rotura de cada uno de los cromosomas implicados en la traslocación. Las dos sondas que flanquean el mismo punto de rotura están marcadas con el mismo color ( ej. Las dos sondas para el 11 en verde y las del 14 en rojo).

FISH INTERFÁSICA En células normales se observan cuatro puntos fluorescentes, dos verdes y dos rojos, correspondientes a los cuatro cromosomas normales ( cada par de sondas, al hibridar en regiones adyacentes, se visualizan como un único punto). Si existe traslocación, se observará: Un punto verde, correspondiente al cromosoma 11 no traslocado. Un punto rojo, correspondiente al cromosoma 14 no traslocado. Dos puntos amarillos, correspondientes a los dos cromosomas derivados de la traslocación, fusión de parte del cromosoma 11 y parte del cromosoma 14.

FISH METAFÁSICA La técnica de FISH metafásica consiste en la detección de secuencias de ADN directamente en los cromosomas sobre extensiones citogenéticas de metafases. Se utilizan las siguientes sondas: Centroméricas: detectan anomalías numéricas Específicas de locus: detectan anomalías estructurales. (la utilización conjunta útil para las traslocaciones) Sondas teloméricas: se utilizan para estudiar alteraciones numéricas o de patologías producidas por deleciones .

FISH METAFÁSICA Se han desarrollado técnicas de FISH metafásica que utilizan cócteles complejos de sondas que cubren cromosomas enteros o incluso el genoma completo, lo que permite “pintar” los cromosomas con diferentes colores fluorescentes. FISH para pintado de cromosomas enteros. FISH multicolor. Cariotipo espectral. Hibridación genómica comparada convencional (CGH).

FISH METAFÁSICA FISH PARA PINTADO DE CROMOSOMAS ENTEROS (WCP-FISH). Se utilizan sondas marcadas con el mismo fluoróforo que hibridan con un cromosoma entero, pintándolo de un color uniforme. Detectan anomalías numéricas, sobre todo , traslocaciones. FISH MULTICOLOR (M-FISH). Permite la identificación de regiones cromosómicas. Se utilizan cócteles de sondas, que hibridan en distintas regiones de un mismo cromosoma, con solapamiento parcial, y que están marcadas con distintos fluoróforos: sondas para pintado de bandas específicas o sondas BSP. El resultado final es un bandeado multicolor característico de cada cromosoma. Útiles para estudiar anomalías estructurales.

5.9.3. FISH METAFÁSICA CARIOTIPO ESPECTRAL (SKY).
Es la suma de los dos anteriores. Se basa en la utilización de sondas WCP y en la combinación de fluoróforos. En concreto, se hibridan simultáneamente todos los cromosomas con un cóctel de 24 sondas WCP, una por cada par de cromosomas. Cada sonda va marcada con una combinación distinta de fluóroforos, de manera que combinando cinco fluoróforos diferentes (que emiten en las regiones del espectro magenta, rojo, naranja amarillo y verde), se consiguen hasta 31 combinaciones diferentes, cada una con un espectro de emisión característico. La lectura microscópica del cariotipo requiere un sistema de análisis espectral de cada cromosoma, que asigna a cada combinación de fluoróforos un color convencional de una paleta de colores. Útil para el estudio de cariotipos complejos con múltiples alteraciones numéricas y estructurales.

FISH METAFÁSICA HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARADA CONVENCIONAL(CGH). En este caso la hibridación se realiza sobre cromosomas en metafase y el resultado se visualiza con un microscopio de fluorescencia. Se detectan deleciones o duplicaciones de varias megabases.

FISH versus CISH

5.10. ISH CROMOGÉNICA (CISH)
Se caracteriza porque el híbrido se detecta mediante una reacción inmunohistoquímica que produce un producto coloreado visible con un microscopio óptico convencional de luz transmitida. Se usa principalmente sobre secciones de tejido FFPE porque las muestras que se han fijado con formol adquieren cierto nivel de fluorescencia, por lo que en muchos casos la interpretación de una técnica FISH sobre este tipo de muestras es muy problemática. Aplicaciones: Detección de secuencias génicas de virus oncológicos ( por ej. Papiloma humano). Detección ARNm de las inmunoglobulinas para estudiar la clonalidad de infiltrados linfocitarios. Estudios de expresión génica mediante la detección de ARNm concretos.

5.10. ISH CROMOGÉNICA (cish)
PROTOCOLO GENÉRICO. Como en cualquier técnica de hibridación, el protocolo genérico de la CISH incluye los pasos de hibridación, lavado de poshibridación y detección del híbrido. La diferencia está en la preparación previa de las secciones de tejido para facilitar la hibridación y en la complejidad de la detección, que se realiza en varios pasos. Desparafinado y rehidratación. Esto se consigue por inmersión sucesiva de los portaobjetos con las secciones de tejidos en cubetas con disolventes orgánicos, como el xilol, para eliminar la parafina y alcoholes de gradación decreciente hasta agua destilada o tampón para rehidratar el tejido.

II. Digestión enzimática. Durante la fijación , el formol produce enlaces entrecruzantes entre las proteínas y otras macromoléculas. El tratamiento enzimático libera a los ácidos nucleicos de su unión a histonas y otras proteínas y permeabiliza el tejido para que las sondas puedan acceder libremente a su secuencia diana. Las dos enzimas más utilizadas son: Proteinasa K: dependiente de la fijación, requieren más tiempo de digestión. Pepsina: Independiente de la fijación. Funciona mejor si se realiza previamente una hidrólisis ácida de los ácidos nucleicos con HCl 0.1N.

III. Prehibridación. Finalidad: bloqueo de posibles uniones inespecíficas de la sonda, en este caso al tejido. Se realiza inundando el tejido con una solución de prehibridación que contiene ADN de esperma de salmón fragmentado. IV. Hibridación. Una vez inundado el tejido con la solución de hibridación con la sonda, se procede a la codesnaturalización de sonda y ADN de la muestra. Para ello se deposita sobre el tejido una pequeña cantidad de sonda, se coloca un cubreobjeto encima, evitando la formación de burbujas y se coloca el portaobjeto sobre una placa calefactora.

El tiempo de desnaturalización tiene que ser suficiente para que se separen totalmente las cadenas de ADN sin que se produzcan burbujas entre porta y cubre ni se seque la sonda. La detección de secuencias de ARN con sondas de ARN no requiere este paso. A continuación, el portaobjetos se coloca en una cámara húmeda para evitar la desecación de la sonda y se incuba a la temperatura y el tiempo recomendados por el fabricante.

V. Lavado de poshibridación. Los portaobjetos se lavan por inmersión en soluciones de poshibridación durante los tiempos y a las temperaturas indicadas por el fabricante. VI. Detección del híbrido. Las sondas utilizadas en CISH se marcan con haptenos y se detectan por métodos inmonuhistoquímicos indirectos amplificadores de señal, con los que se obtiene al final un producto coloreado que se deposita en el tejido alrededor del híbrido. Las sondas plasmídicas de gran tamaño incorporan muchas moléculas marcadoras, por lo que requerirán sistemas de detección menos sensibles, mientras que las sondas oligonucleotídicas pequeñas requerirán sistemas de detección ultrasensibles.

VII. Contratinción. Tras el revelado del marcaje, en el tejido aparecen manchas coloreadas en las regiones en que se encuentra la secuencia diana. Sin embargo, el resto del tejido no es visible al microscopio, por que no se puede interpretar el resultado. Por eso es necesario contrateñir el tejido con una tinción suave, que no enmascare el resultado de la ISH, pero que permita analizar el resultado en el contexto de detalles morfológicos (pej, hematoxilina de Mayer). VIII. Visualización. Las preparaciones se visualizan con un microscopio óptico de luz transmitida. La reacción coloreada se observará en el núcleo o en el citoplasma de las células que lo contengan.

CONTROLES. Control positivo de la técnica. Sirve para comprobar que todos los reactivos funcionan correctamente. Se realiza hibridando una muestra conocida que contiene la secuencia diana. 2. Control positivo de la muestra. Sirve para comprobar que el tejido ha sido tratado adecuadamente y que la fijación se ha efectuado bien, de manera que el tejido conserva sus ácidos nucleicos aptos para la hibridación . Se realiza con sondas específicas de secuencias repetidas ALU para ADN y sondas poli-T para ARN.

3. Control negativo de la técnica. Sirve para comprobar que ningún reactivo empleado tiñe de manera inespecífica algún componente del tejido del mismo color que el marcaje empleado. Se realiza exactamente igual que la reacción problema, eliminando la sonda de la solución de hibridación. 4. Control negativo de la muestra. Sirve para comprobar que el resultado observado es específico y no obedece a uniones inespecíficas de la sonda a diversas estructuras del tejido. Este control se realiza sustituyendo la sonda específica por secuencias no complementarias con los ácidos nucleicos de la muestra.

UD 5 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

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