Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Presentación del tema: "Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)"— Transcripción de la presentación:

1 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Es una técnica que permite analizar rápidamente la secuencia de un gen a partir de una pequeña muestra de material biológico. Mediante esta técnica pueden generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una molécula de ADN.

2 ETAPAS PCR 1. Calentar el ADN a altas temperaturas que pueden ser próximas a la ebullición (1 minuto a 94 ºC) . Cada una de estas cadenas actuará como molde para fabricar su complementaria. 2. A continuación se baja la temperatura para conseguir que cada cebador se una a su región específica dentro de la cadena de ADN (45 segundos a 54 ºC). 3. Generación de la cadena de ADN complementaria por acción de la ADN polimerasa

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4 La reacción es un proceso cíclico:
La molécula de ADN que va a copiarse se calienta entre 94 y 96 ºC para que se desnaturalice y se separe las dos hebras. Se baja la temperatura entre 55 y 65 ºC durante 20 a 30 segundos para que el primer o cebador añadido pueda aparearse con la hebra de ADN. Cada una de las hebras es copiada por la ADN-polimerasa a 72 ºC (Se utiliza la ADN-polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales, Thermus aquaticus, así la enzima puede trabajar a altas temperaturas). Las cadenas recién formadas son separadas de nuevo por el calor y comienza otro nuevo ciclo de copias. Estos ciclos se repiten hasta que se obtiene el número de copias deseado.

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6 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

7 APLICACIONES DE LA PCR :
1) Secuenciación Una de las razones mas comunes para el uso de la PCR es la formación de suficiente cantidad de ADN molde para su secuenciación. Es mucho mas sencillo y rápido que la clonación en células. 2) Estudios evolutivos Mediante la PCR se pueden amplificar genes de organismos ya extintos, como del mamut, o restos antiguos humanos. Se pueden comparar estos genes con los genes semejantes de organismos actuales y poder reconstruir árboles filogenéticos. El PCR también se ha utilizado para conseguir el mapa del genoma humano.

8 3) Huellas dactilares del ADN.
La determinación de las huellas dactilares genéticas constituye una de las aplicaciones más interesantes de la PCR. Mediante esta técnica es posible comparar muestras diferentes de ADN para comprobar si pertenecen al mismo individuo o no, o si existe parentesco entre ellas. Esta técnica se aplica actualmente en Medicina forense e investigaciones policiales, con el fin de identificar individuos a partir de muestras biológicas, como sangre, semen, piel o cabellos. También se utiliza en las pruebas de paternidad.

9 La huella dactilar de ADN, también conocida como análisis del perfil de ADN, se basa en el uso de la técnica de transferencia e hibridación de Southern para analizar regiones polimórficas del ADN humano. Pasos: 1. Extracción del ADN Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima muerta, células del folículo capilar y saliva. El ADN extraído de las pruebas del delito ("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con el extraído de muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la sangre. 

10 2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción, que es una enzima que corta el ADN bicatenario en donde tenga una seuencia característica. La enzima que se usa más frecuentemente para el análisis legal es HaeIII, que corta el ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'. 

11 3. Electroforesis en gel de agarosa Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas menores se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de mayor tamaño. Como resultado, se produce una separación continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de modo que los fragmentos más pequeños avanzan la mayor distancia con referencia al origen o punto de aplicación de la muestra.

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13 PROCESO DE ELECTROFORESIS Se prepara una mezcla de fragmentos de ADN y se ponen en distintas soluciones. Los fragmentos se desplazan en relación inversa con su tamaño

14 MOVIMIENTO DE TROZOS DE ADN

15 Animacion electroforesis en gel de agarosa

16 TEST aplicado a un varón, una mujer y sus cuatro hijos/as.
¿Cuál de los hijos/as es, el que con menor probabilidad, desciende de esta pareja?

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18 Esta figura muestra la parte significativa de la autorradiografía de un análisis, con sonda de locus único, de varias muestras de ADN procedentes de la investigación de una violación. Las muestras de ADN se cargaron en las calles del gel de este modo: 1. Muestra de sangre de la víctima. 2.- Muestra de sangre del acusado. 3.- Marcadores de tamaño de ADN. 4.- Fracción femenina de la muestra vaginal de la víctima. 5.- Fracción masculina de la muestra vaginal de la víctima. Si Ud. fuera el analista de ADN, debería sacar como conclusión: A. El sospechoso es culpable. B. El sospechoso podría ser culpable, pero deben usarse más sondas. C. La muestra vaginal procede de una víctima errónea. D. El sospechoso queda excluido como origen del ADN presente en la prueba del delito. E. NINGUNA de éstas.

19 D. El sospechoso queda excluído como origen del ADN presente en la prueba del delito.
La banda superior de la calle 5 (la fracción masculina de la muestra vaginal) no se corresponde con ninguna de las bandas de la calle 2 (la muestra del acusado), lo que permite descartar a éste como origen de aquel ADN. - Es la correcta.

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22 OBTENCIÓN DE VACUNAS RECOMBINANTES

23 Diagnóstico de enfermedades de origen genético.

24 Técnicas indirectas usadas en la agricultura:
transformación por Agrobacterium tumefaciens 2.- Técnicas directas: - Electroporación - Microinyección, - Liposomas - Otros.

25 Técnicas indirectas usadas en la agricultura: Transformación de células mediada por Agrobacterium tumefaciens.

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27 Electroporación. Proporciona un pulso eléctrico que permeabiliza la membrana celular, permitiendo la incorporación de moléculas como proteínas y DNA.

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29 PLANTAS TRANSGÉNICAS

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32 Agrobacterium damages at least 1
Agrobacterium damages at least 1.4 million dollars worth of agriculture per year in California and Oregon alone. Most serious on cherries, apples, raspberries and blackberries and a few other tree fruits. It is also a problem on roses and several other ornamental trees and shrubs.

33 Agrobacterium is used to transfer DNA into plant cells
Agrobacterium is the only known prokaryote to transfer genes to a eukaryote. Agrobacterium is used to transfer DNA into plant cells Agrobacterium tumefaciens attached to a plant cell. Image by Martha Hawes Agrobacterium is the only known prokaryote to transfer genes to a eukaryote. Agrobacterium is used throughout microbiology to transfer DNA into plant cells

34 Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes infect wounded plants and transfer plasmid DNA (T-DNA) and virulence (Vir) proteins into plant cells. Agrobacterium tumefaciens and A. rhizogenes infect wounded plants and transfer plasmid DNA (T-DNA) and virulence (Vir) proteins into plant cells. The Plasmid shown here in the plant cell codes for T-DNA and Virulence proteins, this T-DNA is then transferred to the host with the aid of the virulence proteins. You can see a cellular view in which a portion of the plasmid DNA and the Vir proteins are transferred here This dna then encodes for oncogenes and enzymes that aid in the synthesis of opines, which is an amino acid and sugar complex that the bacteria can metabolize and use as an energy source. Thus the bacterium has the plant make food for it.

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36 ▪ Aplicaciones en animales
Estudiar la función de genes específicos. Poder utilizar a mamíferos como biorreactores para la producción de proteínas humanas. La corrección de errores innatos de metabolismo mediante terapia génica. La transgénesis se puede efectuar por: Microinyección de cigotos Manipulación de células embrionarias

37 POR TRANSFERENCIA NUCLEAR
CLONACIÓN DE ANIMALES POR TRANSFERENCIA NUCLEAR

38 Clonación de oveja

39 Se cumplen 20 años de la clonación de la oveja Dolly
martes 5 de julio de 2016 Se cumplen 20 años de la clonación de la oveja Dolly La oveja Dolly, el primer mamífero clonado a partir de una célula adulta y uno de los hitos más celebrados en el campo de la investigación genética, habría cumplido este martes veinte años.

40 Su creador, el científico británico Ian Wilmut, afirmó: "Es probable que alguien hubiera llegado a las células madre pluripotentes inducidas (IPS, en inglés) por otros caminos, pero ese proceso, que es la clave para otras muchas cosas, se hubiera retardado varios años, quizás hasta veinte", afirmó Wilmut. Dolly nació el 5 de julio de 1996 en un laboratorio del Instituto Roslin, en Edimburgo (Escocia), a partir del material genético que se extrajo de una célula adulta y se introdujo en un óvulo. La existencia de la oveja no se divulgó, sin embargo, hasta 1997, cuando los científicos estuvieron seguros de que la oveja estaba sana e iba a sobrevivir. La clonación de Dolly abrió un debate sobre la posibilidad de aplicar ese tipo de técnicas en humanos, un aspecto en el que hay que ser "muy cuidadosos", afirmó hoy Wilmut.

41 "Si hay un procedimiento que te permita corregir una enfermedad o ayudar a alguien de alguna forma, y recibe la aprobación en un contexto amplio, entonces estaría a favor", puntualizó el científico. Wilmut se mostró en cambio en contra de cualquier intervención genética para alterar características humanas como la apariencia física o la inteligencia: "No puedo imaginar una situación en la que eso resultara apropiado", señaló. Dolly murió el 14 de febrero de 2003, con seis años, cuando los científicos decidieron sacrificarla debido a una infección pulmonar que padecía. Tras su muerte, el cuerpo de Dolly fue donado al Museo Nacional de Escocia, en Edimburgo, donde se ha convertido en una de las atracciones más populares

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44 OBTENCIÓN DE UNA CERDA TRANSGÉNICA

45 Se combinó el gen de la hormona de crecimiento somatotropina humana con la porción reguladora de un gen de ratón y se inyectó en óvulos fecundados de ratón. Los ratones transgénicos resultantes crecieron hasta el doble del tamaño normal, indicando que el gen humano se había incorporado al genoma del ratón y estaba produciendo hormona de crecimiento. Dado que el DNA se había inyectado en los óvulos, apareció en todas las células, incluyendo las células germinales, y así pudo ser transmitido a la generación siguiente.

46 Vacunas fabricadas por biotecnología para prevenir enfermedades
Algunas de las vacunas actuales se producen mediante técnicas de ingeniería genética. Son más eficaces y seguras. Incluso se estudian vacunas comestibles. La vacuna contra la hepatitis B fue el primer exponente de esta nueva generación de inoculantes. En la actualidad se están estudiando vacunas contra diferentes enfermedades, como la malaria, el herpes, el sida, el cólera y el dengue, entre otras.

47 ¿Qué es el Genoma Humano?

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50 Un borrador inicial del genoma fue terminado en el año 2000 (anunciado conjuntamente por el presidente Bill Clinton y el primer ministro británico Tony Blair el 26 de junio, 2000) Proyecto terminado en abril del 2003

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52 Mapas genéticos

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55 ¿Por qué esta magnífica tecnología científica, que ahorra trabajo y nos hace la vida mas fácil, nos aporta tan poca felicidad? La repuesta es está, simplemente: porque aún no hemos aprendido a usarla con tino Albert Einstein