Sistema CRISPR – Cas9 Gene editing Ariel Waisman ! gracias.

Presentación del tema: "Sistema CRISPR – Cas9 Gene editing Ariel Waisman ! gracias."— Transcripción de la presentación:

1 Sistema CRISPR – Cas9 Gene editing Ariel Waisman ! gracias

2 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Sistema de defensa de procariotas contra el ataque de virus Función: destruir el genoma - ADN / ARN - viral Existen 11 sistemas distintos Qué organismo provienen Tipo de proteína nucleasa Cas Target: RNA o DNA CRISPR – Cas9 dependiendo de

3 2012 CRISPR – Cas9 NUCLEASA (Cas) RNA GUÍA Science

4 CRISPR – Cas9 guideRNAs Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Regiones Spacer repetitivas Regiones Protospacer de origen viral spacers bacterianas variado repertorio de inmunidad contra fagos

5 CRISPR – Cas9 Double Strand Break!! Destrucción del genoma viral

6 CRISPR – Cas9 Sec guía propiamente dicha scaffold target

7 sgRNA Requerimiento: la secuencia target tiene que estar seguida inmediatamente río abajo por una secuencia PAM: 5′-NGG Compuesto por… Secuencia guia Secuencia “Scaffold” ¿Puedo “targetear” cualquier secuencia de un genoma? 5′-NGG La endonucleasa Cas9

8 Gene editing Capacidad de eliminar, reemplazar, modificar secuencias de un genoma en forma altamente específica No al azar! creando un sistema que genera DSB en una secuencia determinada ¿Cómo nos podría servir esto para hacer Gene editing? componentes Cas9 + sgRNA bueno….trasladando CRISPR a eucariotas…

9 Una vez generado el DSB en el genoma… Dos formas de “reparación” por la célula: Non homologous end joining (NHEJ) Homologous Recombination (HR) Genera INDEL mutations Cambio marco de lectura o aparición de STOP prematuro Knock-out del alelo Si además agregamos un vector “de reparación” con secuencias homólogas flanqueando la modificación que se quiere hacer… Knock-in del alelo

10 ¿Cómo hacemos que se exprese la Cas9 y el sgRNA? O variantes… Vector básico:

11 Cuidado con los Off-targets! Pero… …todo es color de rosas? Lo bueno: Software permite predecirlos en base a su secuencia y verificarlos ¿Algo puede malir sal? ¿Cuán específico es?

12 Queremos generar una línea celular con un alelo de un gen knockeado… Diseñar secuencia guía teniendo en cuenta PAM (5’ – NGG) Clonar secuencia guía en el vector sgRNA/Cas9 Transfectar células con el vector Seleccionar células transfectadas (Puromicina, si usamos pspCas9) Seleccionar clones recombinados (Ejemplo, expresión de GFP de HDR) Validarlos (PCR genómica y secuenciación) Validar no haber generado OFF-targets Se hace con la ayuda de un software (o el knock-in lleva tmb gen de resistencia a otro ATB, ej, neomicina) PCR y y secuenciación En células transfectadas (no todas) se expresa Cas9 y sgRNA. En algunas, ocurre el DSB en algún alelo (o en ambos) Si deseamos knock-in, también agregar vector con la otra versión del gen Entonces…

13 Knock-out para animales modelo de enfermedades humanas directamente inyectan RNA de Cas9 y sgRNA en cigotos !! evitan quimeras Modifican 5 genes distintos en un solo paso!!! Con uno de esos genes (Tet3), consiguieron: de 8 blastocistos obtenidos: 3 homocig, 3 heterocig y 3 fallaron 2013 un ejemplo:

14 ¿También sirve para hacer transgénicos? Claro! Y de manera sitio-dirigida Por ejemplo, en ratones: Una forma Modificar células madre embrionarias Inyectarlas en blastocistos Transferir a madre adoptiva y obtener animales quimera Otra forma Directamente en cigoto y transferir blastocisto resultante a madre adoptiva: crías genéticamente homogéneas, es decir no-quimeras

15 Y la construcción? + Se agrega un vector “de reparación” con secuencias homólogas (“brazos” ) flanqueando la modificación que se quiere hacer… el reemplazo ocurre mediante HR ejemplo: tagging de proteínas endógenas; evita introducir proteína taggeada exógena

16 ¿Y terapia génica…? Ratones con una mutación puntual en el gen Fahdaño hepático severo Pero si les inyectan en la cola sgRNA + Cas9 + secuencia WT es un knock-in ssDNA de 180 b!! Con “bracitos” de homología reparación de la mutación (2014) 32: 551–553.

17 Ventajas del sistema CRISPR Sólo hay que diseñar un sgRNA y no una proteína! Es mucho más barato, más rápido y más fácil Se pueden hacer múltiples modificaciones en el genoma al mismo tiempo. Ratones con muchos genes mutados al mismo tiempo Grandes deleciones usando 2 target sites Más eficiente que Zinc finger nucleases y que TALEN

18 Ademas… Se diseñaron variantes la proteína Cas9 nCas9: Proteína “nickasa” (le falta un dominio). En vez de generar DSBs, genera nicks en una cadena. Reduce la frecuencia de NHEJ y favorece HDR Cas9 sin actividad endonucleasa: se dirige al sitio, pero no lo corta: Se la puede fusionar a GFP y mostrar la ubicación de un locus en células vivas.

19 Desventajas y peligros Se pudo “editar” el genoma de líneas celulares humanas, ratones, zebra fish, plantas, drosophila, C. elegans, levaduras y bacterias. Conclusión… Y recién empieza! Su rápida evolución deja poco tiempo al análisis ético y de bioseguridad Organismos editados por CRISPR podrían perturbar ecosistemas Se han modificado embriones humanos con CRISPR en el laboratorio. Creación de virus que distribuyen CRISPR para generar modelos de cáncer de pulmón El peligro de los Off-target en el uso biomédico CRISPR-Cas9 arrancó con todo!

20 Gracias!