Patología Molecular. La Patología Molecular se circunscribe únicamente a las alteraciones moleculares de las proteínas que se originan como consecuencia.

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1 Patología Molecular

2 La Patología Molecular se circunscribe únicamente a las alteraciones moleculares de las proteínas que se originan como consecuencia de una alteración genética”. Como trata de enfermedades, no de enfermos, su enseñanza, se encuadra dentro del área Bioquímica y Biología Molecular, en íntimo contacto con otras disciplinas como Patología, Genética, Pediatría o Análisis Clínicos.

3 Patología molecular Debe resolver el efecto de una mutación en la cantidad o función del producto génico y explicar por qué el cambio es patógeno o no para cualquier célula, tejido o etapa de desarrollo en particular. Además trata de explicar por que un cambio genético determinado debe dar como resultado un fenotipo clínico particular.

4 Nomenclatura para describir el efecto de un alelo. Alelo nulo o amorfo: alelo que no produce un producto, ósea se elimina por completo la función del gen. Hipomorfo: alelo que produce una cantidad o actividad reducida de producto, ósea aún conserva algo de su actividad.. Hipermorfo: alelo que produce una cantidad o actividad mayor de producto. Neomorfo: alelo con actividad o producto nuevo. Antimorfo: alelo cuya actividad o producto antagoniza la actividad del producto normal

5 Efectos de la secuencia de un alelo En estudios genéticos es importante conocer la secuencia de un alelo mutante, pero en patología molecular es necesario conocer lo que sucede en consecuencia.  Perdida de la función Fenotipo recesivo-Fenotipo normal Haploinsuficiencia-Fenotipo anormal Efecto dominante negativo (por alelo antimorfo)  Ganancia de función Fenotipo dominante anormal-señalamiento inapropiado El producto realiza algo nuevo por ganancia de función-Neomorfo

6 Mutaciones con perdida de la función Son mutaciones que perturban la función de los genes (por ejemplo inactivando o reduciendo la actividad de sus productos). En la mayoría de los casos tras un defecto genético la cantidad de producto génico no es crucial y puede obtenerse la mitad de lo normal y no pasa nada en el fenotipo. Cuando un fenotipo clínico es resultado de la perdida de la función de un gen podría esperarse cualquier cambio que inactive el producto génico para producir el mismo resultado clínico, ya sea por sustituciones de aas, cambio de marco de lectura, mutaciones de empalme y a veces la deleción completa del gen.

7 Haploinsuficiencia Es cuando la reducción de 50% del nivel de la función génica causa un genotipo anormal. Son casos en los que la disminución de la dosis génica al 50% de lo que es habitual ya es capaz de provocar el fenotipo patológico. La haploinsuficiencia se produce cuando un organismo diploide tiene sólo una única copia funcional de un gen y la única copia funcional no produce suficiente producto, lo que lleva a un estado anormal o enfermo. Es responsable de algunos pero no todos los trastornos autosómicos dominantes.

8 Efecto dominante-negativo Consiste en que ciertos tipos de genes codifican moléculas que funcionan como dímeros o forman parte de complejos multiméricos, de modo que basta la mutación en uno de los alelos del gen para que las moléculas proteicas mutantes desestabilicen totalmente los complejos de los que forman parte. Hay dos ejemplos típicos que ilustran muy bien este fenómeno: A. Enfermedades que afectan a los genes que codifican alguna de las cadenas de colágeno. B. Enfermedades que afectan a los genes de receptores de las vías de transducción de señales. Otro modo por el que mutaciones con pérdida de función pueden dar lugar a fenotipos de herencia dominante es el efecto dominante-negativo. El efecto dominante negativo es cuando un polipéptido mutante no funcional interfiere con la función del alelo normal en una persona heterocigoto (alelo antimorfo).

9 Mutaciones de ganancia de función Las mutaciones con ganancia de función suelen causar fenotipos dominantes, por que la presencia del alelo normal no impide que el alelo mutante se comporte de manera anormal en una persona heterocigota. La adquisición de una función nueva es rara en enfermedades hereditarias pero frecuente en el cáncer. Esto causa de manera inapropiada un señalamiento o de control inapropiado, que señala cuando no debe o no suprime el señalamiento cuando debería. El único mecanismo para generar genes funcionales nuevos es cuando un reordenamiento cromosómico une exones funcionales de dos genes distintos

10 Los mecanismos por los que las mutaciones pueden originar una ganancia de función que se manifieste en un fenotipo dominante son variados como puede ser una mutación que altera la proteína de forma que ésta adquiere una nueva función. Las mutaciones con ganancia de función son muy frecuentes en cáncer, siendo uno de los principales mecanismos de activación de oncogenes. Por ejemplo, la fusión de los genes BCR y ABL, en pacientes con leucemia mieloide crónica, es el resultado de una translocación (9;22). Esto provoca un nuevo gen de fusión que conduce a una expresión constitutiva y des-regulada de la tirosina-kinasa ABL en células de la serie mieloide en la médula ósea, lo que lleva el desarrollo de la leucemia.

11 Que es el cáncer Nombre aplicado a una variedad de tumores malignos que se forman por el mismo proceso básico de crecimiento descontrolado. El cáncer engloba un conjunto de enfermedades que tiene en común un crecimiento celular desordenado (tumor) y una colonización tisular metástasis todo ello determinado por una mutación inicial seguida de la acumulación de otras mutaciones sucesivas.

12 2) Genes supresores de tumores Tipos de genes relacionados con el cáncer 1) Oncogenes 3) Genes de reparación del DNA Los oncogenes facilitan la transformación maligna y los genes supresores de tumor bloquean el desarrollo del tumor regulando los genes que participan en el crecimiento celular.

13 Oncogenes Los oncogenes son genes que afectan el crecimiento y desarrollo celular normal  Genes que codifican proteínas esenciales para la iniciación, promoción y progresión del estado maligno.  La mayor parte de los oncogenes son formas mutadas o alteradas de genes normales llamados protooncogenes.  > de100 oncogenes diferentes.  Descubiertos a partir de oncogenes virales.  Muchos de ellos han sido relacionados con oncogenes víricos pero no todos. Contraparte de los oncogenes virales. Participan en el control de la proliferación y diferenciación celular. - genes de las células normales que codifican proteínas que regulan la respuesta celular a estímulos externos que controlan la proliferación y diferenciación celular. Protooncogenes / Oncogenes

14 4. Factores de transcripción Genes de crecimiento celular 1. Factores de crecimiento 2. Receptores de factores de crecimiento c-sis: Factor derivado de plaquetas c-erbB: Receptor del Factor de crecimiento epidérmico 3. Proteínas citoplásmicas en la transducción de señales c-abl: Protein cinasa c-src: Proteín cinasa H-ras: Proteína G K-ras: Proteína G c-myc y c-fos: Factores de transcripción FUNCIONES DE LOS PROTO-ONCOGENES

15 Ejemplos de Oncogenes erb-B. Codifica para un receptor de un factor de crecimiento epidérmico; involucrado en glioblastoma y cáncer de mama. erb-B2. También llamado HER-2 o neu; involucrado cánceres de mama, de ovario y de glándulas salivales. Ki-ras. Codifica para una proteína que regula señales estimulatorias; involucrado en cánceres de pulmón, de ovario, de colon y de páncreas. N-ras. Involucrado en leucemias. c-Myc, N-myc y L-myc. Todos codifican para factores de transcripción que activan genes promotores de crecimiento; involucrados en cánceres como leucemias, de mama, de estomago, de pulmón (c-Myc, L- myc), y neuroblastoma (N-myc). Bcl-1. Codifica para la ciclina D1, un componente del ciclo celular; involucrado en cáncer de mama, de cabeza y cuello y linfoma folicular. Ret. Neoplasia endócrina múltiple. Abl. Codifica para una tirosin cinasa; involucrado en LMC (Cromosoma Filadelfia): t (9;22).

16 Genes Tumor Supresor : * Efecto recesivo a nivel celular * Controlan la proliferación celular * >20 genes tumor supresor * Son genes normales cuya función es prevenir el desarrollo de la neoplasia  Se definen por el efecto de su ausencia. “Los tumores se desarrollan en células, cuyos dos genes normales de un gen tumor supresor se han pérdido o inactivado”

17 Tipos de genes oncosupresores Factores inhibidores del crecimiento celular Receptores de factores inhibidores u hormonas que frenen el crecimiento celular Proteínas citoplasmáticas de los sistemas de transducción de señales Factores de transcripción que dirijen la expresión de genes Sus productos frenan el ciclo celular o producen apoptosis Rb y P53 Proteínas que frenan el ciclo celular o producen apoptosis g

18 Oncogén y gen ST

19 Ejemplos de Genes Tumor Supresor APC-4. Involucrado en cáncer de colon; participa en una vía citoplásmica que inhibe la división celular. NF-1. Involucrado en neurofibromas del sistema nervioso y leucemia mieloide; codifica para una proteína que inhibe a Ras, una proteína citoplásmica inhibitoria. NF-2. Involucrado en cánceres del sistema nervioso; codifica para una proteína nuclear. RB. Involucrado en cáncer de retina, de hueso, céls. pequeñas de pulmón y cáncer de mama; codifica para pRB, una proteína nuclear que participa en el ciclo celular. P53. Involucrado en el 60% de todos los cánceres; codifica para p53; una proteína que regula el ciclo celular e induce la apoptosis; la transmisión de mutaciones en línea germinal se asocia a Li-Fraumeni. WT1. Involucrado en nefroblastoma. BRCA1. Involucrado en cáncer de mama y de ovario. BRCA2. Involucrado en cáncer de mama.

20 CANCERES FAMILIARES RAROS POR MUTACIONES DEL GEN SUPRESOR DE TUMOR

21 Genes de Reparación del DNA Proteínas que reparan las mutaciones Difieren de los GTS: – GTS involucrados directamente en la inhibición del crecimiento o diferenciación. – Los genes de reparación DNA están involucrados indirectamente en la inhibición del crecimiento o diferenciación

22 Mecanismos de reparación del DNA

23 Enfermedad Sensible a: Susceptible a: Síntomas Ataxia telangiectasia Rayos gammaLinfomas Ataxia, dilatación de los VS en piel y ojos, alt. cromosómicas y disfunción inmune Sx. Bloom Agentes Alquilantes Carcinomas, leucemias y linfomas Fotosensibilidad, telangiectasias faciales y alt. cromosómicas Sx. Cockaine Rayos UV Enanismo, progeria, atrofia de retina Anemia de Fanconi Agentes que se entrecruzan con el DNA Leucemias Pancitopenia hipoplástica, anomalías congénitas CCNP hereditarioRayos UV, Mut. Químicos Colon y ovario Desarrollo temprano de tumores Xeroderma pigmentosum Rayos UV, Mut. Químicos Carcinoma de piel y melanoma Fotosensibilidad en piel y ojos Defectos en los sistemas de reparación de mutaciones en el DNA y que están asociados a cáncer

24 Pruebas genéticas en individuos y poblaciones HETEROGENEIDAD ALÉLICA Fenómeno por el cual diferentes mutaciones de un solo gen producen un cuadro clínico similar HETEROGENEIDAD GENÉTICA Es cuando mutaciones en diferentes genes producen un cuadro clínico igual.

25 Método para estudiar un gen en búsqueda de mutaciones (Métodos de barrido)

26 El Polimorfismo de Conformación de Cadena Simple o SSCP De sus siglas en Inglés (Single Stranded Conformational Polymorphism) La técnica SSCP usada como método de diagnóstico en Biología Molecular, para genotipar, es decir, permite detectar determinados alelos tanto en homocigosis como en heterocigosis, gracias a que cada alelo, debido a su diferencia en la secuencia genética, migrará con distinta movilidad durante la electroforesis. Esto implica una notable utilidad en el diagnóstico de ciertas enfermedades genéticas. También es ampliamente usada en Virología para detectar variaciones entre diferentes cepas de virus. Dichas cepas son distintas debido a mutaciones, lo que dará a lugar a que adopten distintas conformaciones y por tanto, sean diferenciables mediante un gel SSCP.. La técnica SSCP se ha usado para descubrir nuevos polimorfismos en el ADN, pero actualmente está siendo reemplazada por las nuevas técnicas de secuenciación directa del ADN, dado que son más eficientes y precisas. Esta técnica no permite identificar la mutación concreta; sin embargo, la utilidad de esta técnica deriva de que permite de una manera rápida y sencilla descartar la presencia de mutaciones.

27 Prueba de truncamiento de proteína (PTT) en varones Prueba especifica para mutaciones de cambio de marco, sitio de empalme o sin sentido que causan un codón de paro prematuro. A partir de RT-PCR Ventajas Ignora sustituciones de bases silenciosas o en sentido erróneo, pero a diferencia de SSCP revela el sitio aproximado de cualquier mutación, esta técnica no es fácil de efectuar y no es útil donde las mutaciones no son truncantes como FQ. En mujeres se utilizan para determinar estas delesiones métodos cuantitativos como PCR en tiempo real y otra alternativa es el método de Armour MAPH (Hibridación múltiple con sonda amplificable)

28 Métodos para detectar patrones de metilación Digestión mediante enzimas de restricción HpaII CCGG no metilado y MspI cualquiera, generando diferentes fragmentos de restricción. Secuenciación con bisulfito la citosina pero no la 5-metil citosina (5-MeC) se convierte en uracilo, después del tx se realiza PCR con cebadores compatibles con la secuencia modificada y se secuencia. La citocina y la 5-metil citosina (5-MeC) en el espécimen original se muestran como timina y citocina respectivamente.

29 Métodos de barrido

30 Pruebas para un cambio de secuencia especificado (Pruebas confirmatorias) Prueba para presencia o ausencia de sitio de restricción. PCR-DIG Uso de hibridación de oligonucleótido específico de alelo (ASO) Amplificación mediante PCR específica de alelo (Prueba ARMS) Valoración de ligadura de oligonucleótido (OLA) Mini secuenciación mediante extensión de cebador (SNAPShop) Sondas de amplificación dependientes de ligación múltiple (MLPA)

31 Métodos de prueba para una mutación especificada (Pruebas Confirmatorias) MLPA (SONDAS DE AMPLIFICACIÓN DEPENDIENTES DE LIGACIÓN MULTIPLE)

32 PCR-DIGESTIÓN

33 PCR-DIGESTIÓN Introducción de un sitio de restricción diagnóstica artificial

34 ASO (Allele Specific Oligonucleotide)

35

36 PCR-ARMS Sistema de mutación resistente a la amplificación

37 OLA

38 MAPH y MLPA Hay numerosos métodos para la detección de delesiones muy grandes o de pocos pares de bases, pero surge la dificultad en la detección de delesiones de unas pocas kb. Dos nuevas técnicas se han descrito recientemente que permiten la detección de tales delesiones de tamaño medio mediante el cribado de manera simultanea de perdida o duplicación de hasta 40 secuencias diana. Estos son la múltiple amplificación de sondas hibridadas (MAPH) y la amplificación múltiple de sondas dependientes de ligación (MLPA), el cual es el método MAPH pero mejorado. Ambos se basan en la hibridación de sondas de secuencia específicas con el ADN genómico, seguida de la amplificación de la sonda hibridada y el análisis semi cuantitativo de los productos de PCR resultantes. Las alturas relativas de los picos o las intensidades de banda de cada blanco indican su concentración inicial. Las dos técnicas difieren en la facilidad con que las sondas pueden ser generadas de forma casera y la intensa labor en la realización de la prueba.

39 Hibridación múltiple con sonda amplificable)

40 MLPA MLPA (SONDAS DE AMPLIFICACIÓN DEPENDIENTES DE LIGACIÓN MULTIPLE)