Digestión de ADN usando Enzimas de Restricción Dr. Jesús Lee-Borges Dra. Liza Jiménez Dr. José M. Planas Dr. Jose A. Carde-Serrano Universidad de Puerto.

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1 Digestión de ADN usando Enzimas de Restricción Dr. Jesús Lee-Borges Dra. Liza Jiménez Dr. José M. Planas Dr. Jose A. Carde-Serrano Universidad de Puerto Rico - Aguadilla

2 Objetivos Repasar conceptos básicos de enzimología Conocer sobre enzimas de restricción Usar enzimas de restricción para cortar el ADN. Electroforesis. Separar los fragmentos usando electroforésis. Analizarán un gel con ADN cortado con diferentes enzimas de restricción.

3 Enzimologia Enzimas: E + S  [ES]  [EP]  P + E Energía de Activación Restricción

4 Enzimologia Enzimas: E + S  [ES]  [EP]  P + Energía de Activación Restriccion

5 Enzimologia Enzimas: E + S  [ES]  [EP]  P + Energía de Activación Restricción

6 Historia 1968 – Descubiertas por Werner Arber 1969 – Enzimas de restricción tipo II identificadas por Hamilton O. Smith. Daniel Nathans, ayudo avanzar la técnica de recombinación del ADN (primer mapa genético usando enzimas de restricción). Premio Nobel en Fisiología/Medicina 1978.

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8 Enzimas de Restricción Diferentes tipos – Tipo I – Reconoce secuencias especificas y cortan el DNA en sitios no específicos > de 1,000 pb – Tipo II – Reconoce secuencias palindrómicas y cortan dentro de la secuencia – Tipo III – Reconocen secuencias especificas de 5-7 pb y cortan de 24-27 pb “down stream” del sitio Las enzimas de restricción Tipo II son las mas utilizadas en la biotecnología ya que reconocen y cortan dentro de las secuencias especificas

9 Enzimas de restricción También conocidas como endonucleasas, cortan los enlaces fosfodiester a partir de una secuencia que reconocen.(exonucleasas?) La secuencia que reconocen es una secuencia palindrómica (secuencia que se lee igual en ambas hebras (5’  3’). Son extraídas de bacterias, donde actúan como mecanismo de defensa para degradar material genético extraño que entre en la célula. Las enzimas a usar en este laboratorio - BamHI, HindIII, EcoRI, y Kpn I toman el nombre de las bacterias que la producen: – EcoRI: E = género Escherichia. co = especie coli R = cepa RV 13 I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

10 Enzimas de Restriccion Llamadas enzimas de restricción porque restringen la actividad de bacteriófagos en bacterias Llamadas enzimas de restricción porque restringen la actividad de bacteriófagos en bacterias “Sistema inmunológico” de las bacterias “Sistema inmunológico” de las bacterias Metilasa reconoce la misma secuencia en el DNA de la bacteria y lo metila enzimas de restricción atacan sólo secuencias no metiladas (“restriction/modification systems”)

11 Enzimas de Restricción Se han identificado cientos de enzimas de restricción. Mayoría reconocen secuencias palindrómicas Pueden producir cortes abruptos o pegajosos.

12 Enzimas de Restriccion

13 Las enzimas de restricción al cortar DNA pueden producir dos tipos de cortes: Cohesivos o pegajosos: cortan a manera escalonada en dos puntos diferentes. – 5’ hangfree – 3’ hangfree Abruptos o truncados: cortan en un sólo punto. Bioinformática – Molecular Toolkit Molecular Toolkit

14 Corte cohesivo con EcoRI:

15 Algunas enzimas de restricción Eco RI 5'-G | AATTC Eco RV 5'-GAT | ATC Hin D III 5'-A | AGCTT Sac I 5'-GAGCT | C Sma I 5'-CCC | GGG Xma I 5'-C | CCGGG Bam HI I 5'-G | GATCC Pst I I 5'-CTGCA | G

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18 Bases Teóricas de enzimas de restricción  La actividad de las enzimas de restricción depende de unas condiciones precisas :  pH  Temperatura  Concentración de sal  Iones  Una unidad enzimática (u) se define como la cantidad de una enzima requerida para digerir 1 ug de DNA bajo condiciones óptimas:  3-5 u/ug de ADN genómico  1 u/ug de ADN plasmico

19 Reacción enzimática Buffer (10X)2 μ L DNA (1 μ g)1 μ L Enzimas2 unidades H 2 O_________ 20 μ L Volumen total Enzimas: BAM HI, ECO RI, HIN DIII, KPN I

20 ELECTROFORESIS DE GELATINA

21 ¿Qué es la electroforesis de gelatina? Es un proceso para separar una mezcla de moléculas a través de un material estacionario (“gel”) en un campo eléctrico.

22 Historia 1933 - la técnica fue introducida por Tiselius 1959 - el “gel” policridamida fue introducido por Raymond y Weintraub 1975 - la electroforesis de dos dimensiones fue anunciada por P. H. O’Farrell

23 Geles comúnmente usados: Agarosa: polisacárido extraído de algas. – No tóxico. – Poco poder de resolución pero alto grado de separación. – Separa fragmentos de DNA de 200 a 50,000 pb. Poliacrilamida: polímero de acrilamida. – Tóxico. – Menor grado de separación pero alto poder de resolución. – Usado para fragmentos de DNA de 500 pb. – Usado para separar mezclas de proteínas.

24 Marcadores de Peso Molecular Son usualmente una mezcla de ADN con pesos moleculares conocidos. Son usados para estimar los tamaños de los fragmentos de ADN en una muestra de ADN.

25 Sistema de Amortiguadores TBE vs TAE – TBE: DNA < 1kb Mejor resolucion Alta capacidad de amortiguador – TAE: DNA > 12 kb Menor capacidad amortiguador Para DNA q se va a recobrar Continúa. Discontinúa.

26 Preparación del “gel” Agarosa

27 Preparación del “gel” Agarosa (Cont.) Tiene que pesarse y ser mezclada con el disolvente – Gel agarosa 1% 1.0 g agarosa 99.0 ml 1X TAE

28 Preparación del “gel” Agarosa (Cont.) Como la agarosa no es soluble con el amortiguador a temperatura ambiente tiene que ser hervida.

29 Preparación de gel: La mezcla de agarosa y buffer tiene que ponerse a calentar, agitando frecuentemente hasta que llegue al punto donde comience a hervir.

30 Una vez que el frasco con la agarosa ya pueda tocarse sin quemarse, servir con cuidado la mezcla en la bandeja. Dejar que se torne opaco y sólido. Preparación de gel:

31 Aparato del “gel” Consiste de: bandeja soporte peineta

32 Aparato de “gel” (Cont.) Colocación del “gel” a la bandeja.

33 Aparato de “gel” (Cont.) El tanque es llenado con amortiguador. – 1X TAE

34 Cuando el gel solidifique y se torne opaco, sacar la peinilla y poner gel en cámara de electroforésis con fosas del lado del polo negativo. Proceder a pipetear las muestras en las fosas. Correr gel. Teñir. Aparato de “gel” (Cont.)

35 Práctica de uso de micropipetas: Apoye brazo que esté agarrando micropipeta en superficie firme. Utilice la mano contraria para apoyar la micropipeta Introduzca punta de micropipeta dentro de fosa, sin tocar el gel Vierta el contenido en fosa, presionando botón de la pipeta hasta primer punto de resistencia

36 Aparato de “gel” (Cont.) El “gel” agarosa es cargado con muestras de ADN.

37 Organización del gel cargado con λ ADN/Enzimas de restricción Marcador λ DNA uncut λ DNA/BAM HI λ DNA/ECO RI λ DNA/HIN DIII λ DNA/KPN I ABCDEF Marcador λ DNA/Eco RI

38 Aparato de “gel” (Cont.) Campo eléctrico. – 100 V – 30-45 minutos

39 Aparato de “gel” (Cont.) Distancia migratoria.

40 Aparato de “gel” (Cont.) El “gel”es colocado en un transluminador con luz UV.

41 Aparato de “gel” (Cont.) Partículas de ADN. Cortar las bandas – Guardar en microtubos rotular

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44 ¿Preguntas?

45 Preguntas ¿ Cual es la función de las sales en la eficiencia de las enzimas de restricción? ¿ Por que las enzimas de restricción no atacan el ADN de las bacterias que lo poseen?

46 Qz 4 - Enzimas 1________Cantidad de enzima requerida para procesar 1ug de DNA en condiciones óptimas. 2________ 5'-C | CCGGG 3’; está es la secuencia para la enzima Xma1; como lee la otra parte del palíndrome visto de 5’  3’? 3________ la característica que hace que las enzimas tipo II sean las mas utiles en biología molecular. 4________ la función específica de las enzimas en la célula es? 5________ donde se descubre el fenomeno de “restricción”? Enzima Xba1 viene a concentración de 22000U/ml. Necesito 6 U para una reacción. Cuanto volumen necesito? Lo puedo medir en una pipeta del lab? Como hago para medirlo?