Sesión II: Terapia Génica Eva García Alegría. CAPITULO I  HISTORIA  CONCEPTOS PREVIOS Ingeniería genética Técnica del ADN recombinante Transferencia.

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1 Sesión II: Terapia Génica Eva García Alegría

2 CAPITULO I  HISTORIA  CONCEPTOS PREVIOS Ingeniería genética Técnica del ADN recombinante Transferencia Génica Eficacia de Transfección Genes integrados/ no integrados  TERAPIA GENICA  OBJETIVOS  COMPONENTES Sumario

3 CAPITULO II  TIPOS DE TERAPIA En cuanto a las células diana En cuanto a la técnica empleada  VECTORES Características de elección Marcaje celular Clasificación de los vectores. Vectores no virales Vectores virales

4 CAPITULO III  Estrategias con Ácidos nucleicos Terapia antisentido Reparación génica Ribozimas  Aplicaciones de la terapia génica Enfermedades monogénicas Cáncer VIH  Jurisprudencia y ética en Terapia génica Sumario

5 HISTORIA Enero 1989 Estados Unidos aprueba el protocolo clínico para insertar un gen extraño en las células del sistema inmunitario de pacientes de cáncer. la “tecnología para insertar genes en humanos había llegado”. Septiembre de 1990, se aprobaba el primer ensayo clínico de auténtica terapia génica, introducir el gen que codifica para la enzima adenosin desaminasa (ADA) en niños que padecen una inmunodeficiencia combinada severa (SCID). Febrero 1991 se autorizó también en Italia En 1995 ambos grupos de investigación publicaban los resultados de su experimentación clínica: eficacia de la técnica de TG ex vivo en los “niños burbuja”.

6 HISTORIA A partir de 1990 los protocolos experimentales de TG aumentaron en un progreso continuo. El RAC estimaba 567 pacientes incluidos en los 106 experimentos aprobados de los que sólo una pequeña fracción de ellos están encaminados a la corrección de genes defectuosos, la mayor parte están diseñados para inducir en células específicas, proteínas que hagan a estas células vulnerables al ataque por el sistema inmune de los pacientes.

7 Conceptos previos Ingeniería genética La manipulación de la información genética, con miras al análisis genético o al mejoramiento de una especie. Técnica de ADN recombinante Técnicas de genética molecular que permiten intercalar un segmento de ADN extraño en un ADN receptor. Transferencia génica También conocido como Transducción ó tranfección: es la introducción de material genómico en una célula Eficacia de transferencia: Factor que determina si los genes introducidos en la células se expresan en cantidad adecuada. Dependerá en gran manera de la integración

8 Conceptos Perpetuarse por replicación cromosómica pasando a la progenie expresión estable a largo plazo. Interesante en células madre, población inmortal de células que se perpetúan a sí mismas y de las que derivan el resto de células de un tejido. Genes integrados en el cromosoma.  Inserción al azar. Enorme variabilidad de localización, pudiendo no expresarse.  Puede provocar la muerte celular por integrarse en la secuencia de un gen crucial inactivándolo.  Riesgo de cáncer por variar los patrones de expresión de los genes de proliferación celular. Inactivación gen supresor ó activación de un oncogen

9 Quedan en la célula como elementos extracromosómicos (episomas).  En células en división activa puede darse una segregación diferente en las células hijas del gen introducido. Varia la expresión a largo plazo.  Difícil curar enfermedades que requieran una expresión estable, pero efectivo en terapias como la del cáncer que persiguen una acción del gen hasta la eliminación del tumor. Conceptos Genes no integrados:

10 Transferencia génica realizada en células de individuos humanos con el fin de corregir deficiencias heredadas ó adquiridas y obtener así un beneficio terapéutico

11 OBJETIVOS Complementar ó sustituir el defecto en la función del gen introduciendo una copia del gen normal en estas células. “Inserción génica ó cirugía génica” Inhibir ó bloquear el funcionamiento de genes que contribuyen al desarrollo de la enfermedad. Ej. Terapia del cáncer frente a oncogenes. “Modificación génica” Introducir la información que permita a la célula sintetizar una proteína con efecto terapéutico. Ej: estimulación del sistema inmune

12 Componentes Gen de interés terapéutico Célula diana: célula a la cual va dirigida la transferencia génica. Fuertes para resistir la manipulación Susceptibles de ser extraídas del organismo humano y reintroducidas en él con facilidad Larga vida mejor toda la vida del paciente, (médula ósea, la piel e hígado las que más se ajustan a estos criterios, son las más firmes candidatas para la terapia génica). Vector : sistema ó vehículo utilizado para transferir el material genético al interior de la célula diana

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14 Tipos de Terapia Génica

15 Atendiendo a la célula diana Terapia génica germinal: Dirigida a modificar el acervo genético de las células germinales, implicadas en la formación de los gametos y por tanto transmisibles a la descendencia. Terapia génica somática: Dirigida a modificar las célulcas somáticas que constituyen un organismo. Dicha modificación no es transmisible a la descendencia. Actualmente UNICA TERAPIA CON ENSAYOS CLINICOS

16 Atendiendo a la metodología aplicada In vivo: El material genético es introducido mediante vectores directamente en las células diana del individuo a través del torrente circulatorio. No hay extracción previa ni manipulación in vitro. In situ: La modificación genética de las células del paciente se realiza introduciendo el ADN directamente en elpropio órgano defectuoso del individuo (fibrosisquística, distrofia muscular de Duchenne o la supresión de tumores por “suicidio” celular)

17 Ex vivo: Las células a tratar son previamente extraídas, aisladas y crecidas en cultivo realizando la transferencia génica in vitro. Se devolverán al paciente solo las poblaciones celulares seleccionadas del cultivo en las que se ha comprobado la integración y correcto funcionamiento del transgen. Ej. “Niños Burbuja”

18 ¯ Rasgos fisiológicos del tejido diana ¯ Naturaleza del tejido respecto de los genes a transferir ¯ Facilidad de transferir los genes dentro de las células ¯ La habilidad para llegar al tejido ¯ La respuesta inmune frente al método de transfección Qué metodología elegir

19 VECTORESVECTORES

20 Características de elección de un vector Buena eficiencia en la transferencia génica. La expresión del transgen sea duradera. Dependerá de el tipo de integración del material génico. Tamaño del ADN capaz de transducir. Limita mucho el desarrollo de vacunas. Baja inmunogeneicidad.

21 Marcaje celular Permite identificar y seleccionar in vitro las células diana que hayan incorporado el transgen ó comprobar el grado de transferencia in vivo. Marcaje simple: con gen de resistencia a antibiótico (ej: neomicina) Marcaje doble: cuando se requiera suspender un tratamiento se añade al marcaje simple un gen de selección negativa in vivo., Ej. enzima Timidina Quinasa del Herpes simple, capaz de fosforilar el Ganciclovir, activando y provocando la muerte de la célula transfectada.

22 Clasificación de vectores Vectores No virales  Métodos químicos : –fosfato cálcico –Liposomas – Mediados por receptores  Métodos físicos –Biolística ó disparo de partículas –Microinyección –Electroporación Vectores Virales  Retrovirus  Adenovirus  Herpes virus  Virus adenosasociados

23 METODOS QUIMICOS METODOS FISICOS VECTORES NO VIRALES

24  Primeros vectores desarrollados  ADN exógeno integrado en un plásmido que se mantendrá de manera episómica, independiente del genoma de la célula diana.  Sencillos de producir y más económicos  No tienen limitaciones de tamaño del ADN vehiculizado  Poca toxicidad no inmunogénicos  Baja eficiencia de transducción  Algunos solo validos in vitro

25 Métodos Químicos 1.Fosfato cálcico: Los iones Ca 2+ precipitan el ADN provocando su entrada por endocitosis en el interior de la célula  Expresión transitoria del transgen  Eficacia de transfección del 10%  Utilización sólo en cultivo ex vivo  No provoca toxicidad

26 Métodos Químicos 2.Liposomas catiónicos: Bolsas rodeadas de membrana lipídica capaces de interaccionar con los fosfatos del ADN, condensándolo y con las cargas negativas de la membrana celular mediante enlaces electroestáticos.  In vivo eficacia de transfección disminuida.  Libera el ADN en el citoplasma, evitando la degradación lisosomal.  El ADN compactado queda protegido de nucleasas  No tiene límite de tamaño de ADN a transducir  Baja inmunogenicidad

27 Métodos Químicos 3.Mediado por receptores : Se insertan partículas que serán reconocidas por receptores presentes en el tipo celular diana. Permite un interacción específica transportador/célula. Se les asocian moléculas “fusiógenas” que actúan al acidificarse el medio desestabilizando la membrana del endosoma evadiendo así la acción lisosomal. Endocitosis endosoma acidificación del interior lisosoma degradación.

28 Métodos Físicos 1.BIOLISTICA ADN situado en gotas de 1-3 micras de oro o tungsteno y aceleradas por gas ó por descarga eléctrica.  Fácil manejo.  Varias integraciones en un disparo  Muerte celular en la zona  Capacidad penetración limitada  Variable eficacia de la expresión  Necesidad de muchas dosis.

29 2. MICROINYECCION ADN introducido en el núcleo de las células gracias a un micromanipulador. Se utiliza frecuentemente en estudios ex vivo Métodos Físicos  Evita la degradación lisosomal y citoplasmática  Alta eficiencia en la expresión  laborioso, necesita células aisladas.  Existen células que no sobreviven

30 Técnica del ADN desnudo Inyección directa de la parte codificadora a un tejido. In vivo ADN introducido con una solución salina y administrado intramuscularmente. Se desconoce el mecanismo por el cual entra en la célula.  Método directo, simple, económico  Baja toxicidad  Utilización en Vacunas al alcanzar respuesta inmunológica  Baja eficacia transfección. No se integra en el genoma  Expresión génica corta (días)

31 3.ELECTROPORACION Apertura de los poros de membrana mediante la aplicación de corriente eléctrica, permitiendo la entrada del gen. Métodos Físicos  Células pueden ser aisladas y sometidas a control. Selección de las mejores, cultivadas antes de implantarlas al paciente.  Muchas células no soportan el choque eléctrico. Indicado en células con alta tasa de proliferación

32 RETROVIRUS ADENOVIRUS ADENOASOCIADOS HERPEXVIRUS VIRALESVIRALESVIRALESVIRALES

33 Eliminación de 1 ó mas genes virales imprescindibles para la replicación y sustitución por el gen terapéutico. Mantendrá la capacidad de infectar pero no la replicación y virulencia. Las secuencias necesarias para la replicación se añaden en células ayudantes que soportan la producción del vector, funcionando en trans.  Vectores más utilizados actualmente.  Elevada eficacia de transfección ( incluso 100%) Formación de virus defectivos:

34  Tamaño del gen terapéutico en función del tamaño del virus.  Transferencia y expresión de genes virales Transferencia no deseada del virus nativo Activación de un virus patógeno Activación de un oncogen por recombinación génica con el genoma del huésped  Reacción inmunitaria in vivo por muerte de las células modificadas. Limitaciones de su uso:

35 RETROVIRUS

36 Características Genoma es ARNss y durante su ciclo vital utiliza la maquinaria replicativa de la célula huésped para lo cual se retrotranscribe a ADNds integrándose en el genoma. Organización del genoma: 10Kb que codifican 3 genes gag: antígenos, proteínas de cápsida y matriz pol: transcriptasa inversa, proteasa e integrasa env: proteínas de la envoltura del virus LTRs: Extremos del genoma (ADN ya) con actividades promotoras y secuencias para la integración.

37 Vector retroviral Virus defectivo para genes de proteínas estructurales, gag, pol y env. Extremos LTRs Secuencia de empaquetamiento Unidad transcripcional con el gen de interés. Línea de células envase: contiene copias integradas de los genes virales pero no la señal de empaquetamiento, permite así el desarrollo del vector.

38 Ventajas e inconvenientes  Estrategia pionera en técnicas ex vivo.  Eficaz transducción.Integra hasta 8 kb tamaño.  Integración y expresión persistente  La mayoría se integran en células que se replican (excepto el VIH), lo cual limita su uso como vector.  Derivación oncogénica por incorporación de protooncogenes ó por mutagénesis insercional activando un oncogen adyacente.  Precaución para asegurar la ausencia de virus de replicación competente.

39 ADENOVIRUSADENOVIRUS

40 Características Genoma es ADNds lineal. Su ciclo vital requiere la división celular y provoca una infección productiva de células tolerantes durante la cual se acumulan en el núcleo grandes cantidades de virus. Están asociadas con enfermedades benignas en humanos Organización del genoma: 35 Kb con varias unidades de transcripción, proceso que se realiza de manera secuencial. Genes E1 activa otros genes tempranos Genes E2 proteínas involucradas en la replicación ADN Genes E3 funciones para detener mecanismos de defensa Genes E4 funciones regulan la transcripción entre las fases primaria y secundaria del ciclo viral

41 Vector adenoviral Deficientes para replicarse por lo que necesitan un sistema celular de complementación que produzca los elementos E1 que han sido suprimidos. Línea celular humana 293 que aporta las proteínas.

42  Puede insertar 20Kb  Capaces de transferir el gen en amplia cantidad de células y tejidos  Fáciles de producir en grandes cantidades  Infecta células en reposo ó en división  Expresa varias proteínas virales inmunogénicas, separándose más rápido el vector de las células por la repuesta del hospedador. limitando la duración de la expresión y la capacidad de repetir la dosis Ventajas e inconvenientes

43 ADENOASOCIADOS “AAV”

44 Características Genoma ADNs lineal. Virus muy pequeño y simple.. Requiere la coinfección con adenovirus u otros para replicarse. Extendido en humanos pero no asociado a enfermedad conocida. Se integran de manera específica en el cromosoma 19 en ausencia de virus ayudante. Organización del genoma muy simple, solo 2 genes rep: proteinas involucradas en replicación e integración cap: 3 proteínas estructurales Extremos TR

45 Vectores muy simples con solo las secuencias TR. Lleva consigo la introducción de un plásmido que codifica rep y cap para proveer de las funciones de virus ayudante. Vector AAV

46  Expresión a largo plazo en células que no se dividen.  Estructuralmente simples.  Provocan menor respuesta del hospedador  Tamaño solo de 4 Kb  Transducen células infectadas por Adenovirus  Difíciles de desarrollar en grandes cantidades Ventajas e inconvenientes Se están realizando nuevos VAA que combinen la habilidad de integrarse con mayores fragmentos ADN

47 HERPESVIRUS

48 Características Genoma ADNds lineal. Virus de 100-250Kb.  Gamma: infección latente en células en división, replicándose con la célula y siendo heredado.  Alfa: no pueden mantener la infección latente en células en división. Puede mantenerse de manera episómica indefinidamente en células de larga duración (ej: neuronas sensoriales en HSV) Tropismo específico por el SNC  Beta: desconocimiento de la naturaleza de la infección latente Organización del genoma 2 trozos de ADNds unidos llamados molécula L y molécula S, las cuales se unen por sus secuencias terminales TRL y TRS. Pueden unirse de 4 formas diferentes “isómeros”

49 Vector Herpesvirus Gran variedad en función del tipo de herpes virus. El más conocido es el del herpes simple HSV con los promotores LAT como elementos promesa para dar expresión suficiente en diferentes tipos de neuronas. Los genes virales eliminados se introducen en trans en la célula ayudante.

50  Capaces de llevar grandes secuencias de ADN.  Pueden provocar infección latente de larga duración sin integrarse (episoma). Gran variación dentro de esta familia. Ventajase inconvenientes  Baja eficiencia transducción  Expresión transitoria del gen.  Gamma: asociados a daños proliferativos, incluso malignidad. Identificar los genes responsables y eliminarlos

51 CAPITULO III  Estrategias con Ácidos nucleicos Terapia antisentido Reparación génica Ribozimas  Aplicaciones de la terapia génica Enfermedades monogénicas Cáncer VIH  Jurisprudencia y ética en Terapia génica Sumario

52 ESTRATEGIAS CON ACIDOS NUCLÉICOS s Terapia antisentido s Reparación génica s Ribozimas

53 TERAPIA ANTISENTIDO Oligonucleótidos complementarios a secuencias específicas de un determinado ARNm (secuencia sentido) bloqueando su traducción mediante la formación de heteroduplex y estimulando la Ribonucleasa H. Se han desarrollado también secuencias antigen “tríplices” que interaccionan con ADN formando triples hélices que bloquean la transcripción..  Potencial terapéutico en enfermedades autoinmunes, el cáncer y el SIDA  Corta vida media en la circulación sistémica  Dificultad para acceder funcionalmente al citoplasma y al núcleo celular. Se cambian grupos fosfato para dejarlos sin carga y que penetren mejor.

54 TERAPIA ANTISENTIDO

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56 REPARACIÓN GÉNICA Objetivo: reparar genes alterados por mutación puntual conocida. Método: la activación de los mecanismos celulares de reparación del ADN. Técnica: diseño de oligos específicos para secuencias genómicas adyacentes a la mutación y que llevan un agente capaz de lesionar el ADN

57 RIBOZIMAS ARN con actividad enzimática catalizan reacciones de rotura y ligamiento en lugares específicos de un ARN diana gracias a secuencias guía internas (IGS) que pueden ser variadas cambiando la especificidad del ribozima Requieren de un metal con carga divalente para la reacción química (ej; Mg 2+ ). Capaces de cortar las dianas y repetir el ciclo de unión, rotura y disociación.

58 RIBOZIMAS Optimizar la función a nivel intracelular: Reparto a las células apropiadas: lo más utilizados son los vectores retrovirales y los AAV Expresión intracelular: elección del promotor Co-localización con el ARN diana, aumentando la eficacia. Reciclaje del substrato

59 RIBOZIMAS

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61 APLICACIONES EN TERAPIA GÉNICA HUMANA

62 ENFERMEDADES CANDIDATAS Amenazar gravemente la vida del paciente Órganos tejidos y tipos celulares afectados deben estar bien caracterizados. Versión normal del gen defectuoso ha de estar aislada y clonada. Gen normal debe poderse introducir en una fracción significativa del tejido afectado ó bien en un tejido accesible que revierta indirectamente en el curso de la enfermedad Gen debe poder expresarse de manera que genere suficiente proteína normal.

63 Deficiencia de la Adenosin Desaminasa “Niños Burbuja” Disfunción de las células T y B provocando muerte por infección masiva generalizada. Niños con esperanza de vida limitada al carecer de respuesta inmunitaria. 25% de los casos de SCID. Tratamiento actual: transplante medula osea de donante HLA idéntico, lo cual reduce mucho las posibilidades y además la operación tiene una alta mortandad. También inyecciones con ADA sintética. Terapia Génica: introducción del gen ADA normal por transfección con vector retroviral en linfocitos T aislados del paciente Problemas: resultados variables y posible mutagénesis

64 FIBROSIS QUISTICA Gen de la FQ es el CF ADNc del gen de la conductancia transmembrana CFTR construido y clonado en vector retroviral. Células CF- eran infectadas y seleccionadas posteriormente por un gen de resistencia. Las células transfectadas adicionando estimulador de la adenilato ciclasa expresaban el gen, detectándose funcionamiento de los canales de Cloro La terapia génica de la FQ es también realizada mediante métodos químicos con liposomas catiónicos que llevan el gen CFTR.

65 DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHEME Mioblastos individuales “células satélite”capaces de fusionarse con otras para la regeneración muscular. Ideal como vector. Se logró un ADNc del gen de la distrofina y se clonó en un vector retroviral, con el cual se transfectaron las células. Comprobaron por anticuerpos que se producía la molécula correcta y se localizaba en la membrana celular. Queda mucho para que tenga aplicación clínica

66 HEPATOCITOS Enfermedades metabólicas hereditarias como la Hipercolesterolemia familiar y Hemofilia afectan a este tejido por lo que se han desarrollado técnicas a partir de aislar y cultivar hepatocitos. Hipercolesterolemia provocada por la mutación en el receptor de la lipoproteína de baja densidad LDLR

67 Inyección de un AAV que contiene el gen que codifica para el factor IX. Se suspendió el tratamiento en mayo de 2004 por tener resultados aislados en pocos pacientes. HEMOFILIA B PARKINSON Inyección de un AAV con el gen que codifica el enzima GAD en el cerebro de pacientes afectados. Produce estimulación del ácido GABA Primer experimento de la fase clínica en esta enfermedad, comenzó en agosto 2003. HEMOFILIA A Inyección con células del pacientes una vez transformadas in vitro con un plásmido que contiene el gen que codifica para el factor VIII plasmático. Los pacientes mostraron una modesta mejora.

68 AAV transformado con el un cDNA que codifica para insulina sintética. Se añade un promotor, activo únicamente en células del hígado, y que estimule por la presencia de glucosa. También se ha adicionó un “enhancer” aumentando la expresión y una señal que permita que la insulina sea secretada al medio. DIABETES ESCLEROSIS LATERAL AMIOTROFICA Enfermedad con degeneración en las neuronas motoras. Experimentos en ratones portadores del gen humano mutado de la enzima superóxido dismutasa. Transfectados con AAV mostraron una menor destrucción de las neuronas.

69 FIBROBLASTOS DE PIEL Vehículos para transferir genes. Se obtienen fácilmente, crecen in vitro y son infectados por vectores retrovirales. Mucopolisacaridosis (enfermedad hereditaria caracterizada por deficiencia de enzimas lisosomales). Enfermedad de Gaucher (deficiencia del enzima glucocerebrosidasa) Deficiencia de Adenosin desaminasa Hemofilia B: causada por déficit del factor IX plasmático.

70 Células hematopoyéticas Células madre medulares que dan lugar a todas las células hematopoyéticas, utilizadas como vector para transportar genes al paciente. Fáciles de obtener Crecer bien in vitro Soportar la infección retroviral Fácil de devolver al paciente Continuar viva varios meses Dificultades: bajo nivel de expresión del gen introducido

71 Proteínas Humanas clonadas en cultivos celulares de bacterias y levaduras y crecidas in vitro las seleccionadas con el transgen.  Insulina (para la diabetes)  Factor VIII (para hemofilia A)  Factor IX (Hemofilia B)  Hormona de crecimiento GH  Eritropoyetina ( para tratar la anemia)  Interferones e Interleukinas distintas  Adenosin desaminasa (tratar la inmunodeficiencia severa combinada)  Angiostatina y Endostatina (drogas contra el cáncer)……... Clonación del producto terapéutico

72 TERAPIA GENICA DEL CANCER

73 Estrategias Sustitución de oncosupresores defectuosos Inhibición de la expresión de oncogenes por terapia antisentido Inserción de vectores suicidas. Adenovirus oncolíticos Inmunotoxinas Vacunas tumorales: Aumenta la immugenicidad del tumor introduciendo antígenos foráneos Aumentar la actividad antitumoral de células inmunes por medio de Citoquinas.

74 SUSTITUCIÓN DE ONCOSUPRESORES Oncosupresor: Gen que actúa inhibiendo la proliferación celular y cuya pérdida puede implicar la génesis tumoral. Los más conocidos: rb, p53, dcc,fap,nf1,nf2,wt1 y p16 Terapia genética mediada por vector retroviral que lleve la copia intacta del oncosupresor. Eficacia mejorada al introducir en el tumor varios oncogenes y oncosupresores a la vez, que corrijan las alteraciones acumuladas

75 INHIBICION DE ONCOGENES Oncogenes: genes capaces de producir transformación maligna al expresarse inadecuadamente por una mutación o ampliación Protooncogenes: genes normales con importante papel en la proliferación y diferenciación celular y susceptibles de mutación convirtiéndose en oncogenes. Más de 50 identificados actualmente. Terapia génica antisentido para regular su expresión bloqueando la formación de las proteínas. Éxito in vitro en varios oncogenes, comprobando en animales la desaparición de tumores sin recidivas ni secuelas.

76 INSERCION DE VECTORES SUICIDAS Virus defectivos cuyos genes han sido sustituidos por un gen de selección (neomicina) y otro capaz de inducir su propia muerte (tk de herpes virus). En ratas se ha constatado la muerte de las células tumorales infectadas con retrovirus defectivos al administrar ganciclovir. Humanos: se encuentra en fase de ensayo clínico en tumores cerebrales produciendo, en algunos casos la disminución del tumor. Actualmente se trabajan con promotores específicos de tumor para evitar la muerte de células no tumorales.

77 INMUNOTOXINAS “BOMBAS BIOLÓGICAS” ó balas mágicas: Acoplar anticuerpos tumorales específicos a toxinas mortales actuando como proyectiles dirigidos a células cancerosas. El anticuerpo monoclonal da especificidad al estar dirigidos contra un parte especifica de la proteína. Requisitos de la inmunotoxina: Antígeno en la superficie celular; receptores y carbohidratos de membrana Penetración eficaz del complejo antígeno - anticuerpo en el citoplasma celular Que reconozcan las formas mutadas pero no las normales, o por lo menos se expresen menos en estas.

78 INMUNOTOXINAS Las toxinas más utilizadas son: Ricina T. Diftérica y exotoxinas de Pseudomonas. Su modo de acción es inhibir la síntesis protéica a nivel ribosomal.  Efecto antitumoral más rápido que el desarrollo de la respuesta inmunológica.  No llegan a todas las células cancerosas, sobre todo en tumores sólidos.  Pueden reaccionar con cualquier célula provocando toxicidad no específica.

79 VACUNAS Moléculas con capacidad para provocar respuesta inmune frente a antígenos propios específicos de tejido. 2 tipos de antígenos reconocidos por células T citotóxicas:  Proteínas aberrantes de los oncogenes exclusivas de células tumorales y diferentes a las de protooncogenes.  Productos de genes embrionarios que no se expresan en células adultas. Primeros tratamientos con pequeña respuesta.

80 LINFOCITOS MODIFICADOS Linfocitos infiltrantes en tejidos (TILs): se infiltran en tumores siendo capaces de matar células tumorales al administrarlos con el factor de crecimiento Interleukina 2. Estrategia terapéutica ex vivo, introducidos en células aisladas de tumor, transfectadas por vector retroviral y marcadas con resistencia a neomicina para comprobar el grado de eficiencia. El porcentaje de eficiencia en la transferencia y la pérdida posterior de los linfocitos modificados hacen necesarias más pruebas.

81 TERAPIA GENICA DEL VIH

82 CICLO VITAL

83 OBJETIVOS  Protección de las células no infectadas  Destrucción de las células infectadas  Reducción de la infección en pacientes  Evitar la propagación

84 ESTRATEGIAS I. Estimular sistema inmune al transferir un gen del virus. II. Introducir genes inhibidores de la replicación vírica (interferón). III. Transferir genes de proteínas víricas mutantes que compiten con las normales dificultando el ensamblaje ó la replicación. IV. Secuestro de proteínas víricas reguladoras por señuelos de ARN, evita que se unan a sus puntos de acción. V. Terapia antisentido: Ribozimas y Oligonucleótidos VI. Introducción de anticuerpos frente a proteínas del VIH, inmunización intracelular.

85 Estimulación del sistema inmune Vacunas génicas mediante la expresión de proteína viral por inyección directa de ADN plasmídico que lleva genes virales.  Problema: elevada tasa de mutación que le permite escapar de la respuesta inmune.

86 Inhibición por Interferones ADNs copia de interferones insertados en vectores y transfectadas células diana. Provoca la inducción de algunas proteínas celulares que interactúan con estructuras virales inhibiendo la expresión de proteínas víricas necesarias para la replicación

87 TERAPIA ANTISENTIDO Oligonucleótidos: ARN antisentido vehiculizado por un AAV produce reducción de más de un 90% de la replicación. Necesitan estar en un numero muy elevado. Ribozimas: ARN que cataliza ARN viral, son expresados establemente en células pudiendo inhibir la replicación. No necesitan tanta cantidad porque los ribozimas se regeneran.

88 Interrumpir procesos virales  Modificación de la molécula CD4 no pudiendo infectar la célula.  Introducir proteínas mutantes  Secuestro de proteínas por señales de retención del retículo plasmático.

89 JURISPRUDENCIA Y ETICA EN LA TERAPIA GÉNICA

90 Ley de 28 de diciembre de 1988: prohibiciones y sanciones sobre clonación y utilización de embriones y fetos humanos. Artículos 159 al 162 del código penal de 1995. El 159 protege la integridad de la especie su desarrollo. El 161 defiende la intangibilidad del patrimonio genético humano y la identidad genética de los ciudadanos. Ley sobre Técnicas de Reproducción Asistida: admite la terapia génica en línea germinal (embriones y fetos en el útero) solo si cumplen ciertos requisitos, entre ellos el de una enfermedad en los que la terapia sea posible científicamente y no se influya en los rasgos hereditarios no patológicos ni se busque selección de individuos. LEGISLACION

91 Ley sobre Técnicas de Reproducción Asistida: El gobierno del PP el año pasado delimitó el uso de embriones destinados a investigación a los congelados antes del 2003 y también el número de embriones susceptibles de implantación en el útero. Actualmente se está llevando a cabo por el gobierno socialista una nueva reforma que permitirá además de la investigación de los embriones sobrantes la selección preimplantaciónal de un determinado embrión frente a otro con el fin de obtener un fin terapéutico a un tercero (ej: un hermano con enfermedad hereditaria que podrá ser transplantado con medula ó cordón umbilical del futuro niño). LEGISLACION

92 Declaración de l a UNESCO sobre genoma Humano y derechos Humanos (199 art. 24 invita a identificar aquellas prácticas contrarias a la dignidad humana en clara alusión a la TG germinal. Convenio Europeo de Bioética 1997. Art 13: únicamente podrá realizarse intervenciones que tengan como objeto modificar el genoma humano por razones preventivas, diagnósticas ó terapéuticas siempre que no tengan como finalidad la introducción de una modificación en el genoma de la descendencia. Parlamento Europeo y del Consejo (1998) Art. 6.2b se considera no patentables los procedimientos de modificación de identidad genética germinal del ser humano. LEGISLACION

93 ETICA El fin ultimo de la terapia es obtener un beneficio para el paciente, intentando que lleve una vida normal. Hay peligros potenciales derivados de la técnica y peligros de índole menos noble y más humana. En cuanto a la técnica empleada: Posibilidad de despertar alelos defectivos y genes reprimidos que conlleven incluso mortalidad. Reacciones inmunológicas contra una proteína nueva provocando incluso la muerte. Seguridad de evitar que los vectores vuelvan a ser virus de replicación competente. ¿Están realmente bajo nuestro dominio seres con alta capacidad de mutación?

94 ETICA Riesgo de la Terapia en línea germinal: cualquier modificación se transmite, nuestros descendientes serían genéticamente distintos. El desafío a la ley natural de selección cribando los más adaptados es una puerta al juego, cuanto menos peligroso, de provocar ventajas adaptativas que mejorasen la especie, bajo excusas nobles de salvar vidas. Hay que pensar siempre en las consecuencias posibles de todas las terapias que se administran, y en este caso especialmente porque pueden influir a toda una especie. Por otra parte el negocio de la salud y la búsqueda de los beneficios de todos estos avances hace al hombre más peligroso que muchos virus, olvidando que la salud es un derecho de todos.