María Lizbeth Mendoza López 257573 Microbiología de alimentos.

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1 María Lizbeth Mendoza López 257573 Microbiología de alimentos

2 Introducción 2 El frecuentemente observado gran número de levaduras en quesos podría estar relacionado con Su capacidad para desarrollar a bajas temperaturas Asimilar/fermentar lactosa Asimilar los ácidos orgánicos Actividades proteolíticas y lipolíticas Resistencia contra altas concentraciones de sal

3 Las levaduras participan directa e indirectamente en el proceso de maduración Contribuyen a las características especificas del queso Sabor y textura 3 En los quesos Pecorino Romano y Pecorino di Filiano se han encontrado las levaduras: Debaryomyces hansenii Kluyveromyces marxianus Saccharomyces cerevisiae Y varias especies de Rhodotorula Introducción

4 Queso madurado hecho con leche de cabra y cuajo de cerdo. Producido en la región de Abruzzo, Italia. Principalmente se hace en plantas artesanales con las tradiciones locales. Características organolépticas únicas. Puede ser madurado de 3 a mas de 12 meses. 4 Pecorino di farindola Introducción

5 El objetivo de este trabajo fue identificar y caracterizar algunas de las propiedades tecnológicas importantes de las especies de levaduras presentes en el proceso de maduración del queso Pecorino di Farindola. Se identificaron un total de 156 aislamientos, siendo K. marxianus la especie dominante. 5 Introducción

6 6 Materiales y métodos Se tomaron muestras a diferentes tiempo durante la fabricación y la maduración. Leche cruda, cuajada, “primo sale”. Después de 7, 15, 30, 60, 90 y 180 días de maduración. Las muestras se trasladaron al laboratorio en matraces a 4°C Se utilizaron 4 lotes de queso Pecorino de Farindola (F1..F4), producidos tradicionalmente en diferentes granjas.

7 10g de queso y 90 mL de citrato de sodio fueron homogeneizados Cada dilución paso por duplicado al medio YPD (Yeast Peptone Dextrose agar) mas 150mg/L de cloranfenicol Después del conteo se hizo un análisis de frecuencia para describir la distribución de las especies. 7 28° por 48-72 horas Materiales y métodos

8 Identificación molecular de las levaduras. Se realizó la prueba de la inulina a todos los aislados. PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism ). Amplificando la región 5.8 ITS (Espaciador transcrito interno) de rRNA Se secuenciaron aislados representativos, para la determinación del posición del dominio D1/D2 del rRNA 26s Los fragmentos que fueron amplificados fueron purificados, para posteriormente mandarse secuenciar. Se identificaron las cepas aisladas con las bases de datos Gen Bank DNA database y NCBI. Y se realizó el árbol filogenético con MEGA. 8 Materiales y métodos

9 Tipificación de levaduras Microsatellite PCR fingerprinting Primer M13 (5′-GAGGGTGGCGGTTCT-3′) 9 Materiales y métodos

10 Caracterización de propiedades tecnológicas de las levaduras. Las cepas aisladas se dejaron en condiciones aerobias en agar YPD A 28 °C toda la noche Asimilación de lactosa, galactosa, lactato y citrato, en presencia de diferentes concentraciones de NaCl (0,2.5, 7.5, y 10%) Actividades lipolíticas y proteolíticas Producción de pigmentos marrones 10 Materiales y métodos

11 Cinética de crecimiento de la levadura K. marxianus en suero 39 cepas fueron crecidas en YPD a 28°C Centrifugación a 3000g por 10 min, y fueron lavados y suspendidas con buffer Se agregaron a un matraz Erlenmeyer y se añadio 100 mL de leche de vaca pasteurizada y se sello con parafina. Se inicio la fermentación anaeróbica a 30 °C Las cinéticas fueron monitoreadas gravimétricamente (produccion de CO2) Cuando la producción de CO2 termina, las muestras se almacenan a -20°C Después de 15 días se determino el contenido de ácidos orgánicos con HPLC UV-VIS a 210nm 11 Materiales y métodos

12 Resultados y discusión 12

13 Aislamiento e identificación de levaduras Un rango promedio observado fue: 105 ufc/g despues del primer salado, a 104 ufc/g al final de la maduración (180 dias) Valores similares se observaron en otro tipo de quesos Pecorino. Se aislaron un total de 156 levaduras de los 4 lotes Todas las secuencias que aislaron, mostraron valores similares que van del 99 % a 100 % con referencia a las secuencias, lo que confirma la identidad de los aislados. 13 Resultados y discusión

14 14 Resultados y discusión

15 Durante la maduración de un queso se requiere: pH bajo Bajo contenido de humedad Concentración de sal elevada Baja temperatura Sin embargo la permanencia de las levaduras durante la maduración no esta bien definida. 15 Resultados y discusión

16 Las siguientes levaduras se aislaron en las primeras semanas de maduración, sin embargo hay ausencia de estas con forme pasa la maduración. Pichia kudriavzevii, Candida parapsilosis, Candida glaebosa y Candida zeylanoides Estas levaduras podrian ser contaminantes de la salmuera con una baja capacidad competitiva en el entorno de queso. 16 Resultados y discusión

17 Identificación genética de las levaduras. 17

18 18 Resultados y discusión

19 El fingerprinting de K. marxianus reveló dos perfiles principales: A (presente en 24 de las 125 cepas) Presentó dos bandas a 477 bp y 1331 bp B (presente en 101 de las 125 cepas) Presentó dos bandas a 557 y 494 bp 19 Resultados y discusión

20 En el articulo se reporto una eliminación de un solo nucleótido en las secuencias del rRNA 26 S Sin embargo la variación de un solo nucleótido puede tener un profundo efecto fenotípico, como aumento en la capacidad de la levadura para adaptarse a las condiciones ambientales. Las mutaciones adaptativas asociadas con la habilidad de los microorganismos son raras (1 en 10^11) 20 Resultados y discusión

21 Caracterización fenotípica de las cepas de K. marxianus Anteriormente se demostro que K. marxianus tiene un intervalo de crecimiento de los 30 a los 48°C, y una producción de alcohol a temperaturas por encima de los 40°C. Las 125 cepas en este estudio presentaron un comportamiento similar, sin embargo no crecieron a 48°C Esta capacidad de crecer a altas temperaturas es una caracteristica muy importante dentro de las levaduras industriales. 21 Resultados y discusión

22 La alta tolerancia de la levadura a las concentraciones de NaCl, le puede conferir la capacidad de permanecer en el queso durante la maduración. 22 Resultados y discusión

23 Fermentación de lactosa y degradación de lactato por K. marxianus K. marxianus participa en la desacidificación de la cuajada a través del consumo de lactato / lactosa, con un aumento notable en el pH que permite a las bacterias sensibles a los ácidos desarrollarse en la superficie del queso 23 Resultados y discusión FenotipoNumero de cepas (39) Producción de CO2 175.5 g CO2/100 ml 2 y 311 y 142.2 g CO2/100 ml

24 24 Resultados y discusión

25 Todos estos datos sugieren una alta heterogeneidad en el consumo de ácido láctico y el papel importante de la población de K. marxianus en la maduración de queso es probablemente el consumo de lactosa y la evolución del aroma más que degradación del ácido láctico. Este resultado fue confirmado por los valores de pH del suero fermentado que, en general, se encontró 0,6 unidades menor que el valor de pH de control (pH 4.80± 0,07). 25 Resultados y discusión

26 Un bajo contenido de aminoácidos correspondió a alto contenido de ácido láctico y viceversa 26 Resultados y discusión

27 En conclusión, este estudio mostro cepas fenotípicamente diferentes en cuanto a la cinética de crecimiento en leche, metabolismo de los ácidos grasos (producción/degradación), consumo de aminoácidos, consumo competitivo de aminoácidos y lactato. Lo que le da a estas poblaciones un posible papel como cultivos iniciadores de productos lácteos. 27 Conclusión

28 La alta resistencia a NaCl en la mayoría de los aislados proporciona un recurso para investigar las rutas bioquímicas precisas y las bases genéticas de este y otras respuestas al estrés ambiental de K. marxianus. El análisis molecular destaca la presencia de distintas cepas en un área restringida, lo que sugiere un papel selectivo de cepas para el origen de poblaciones distintivas de K. marxianus Polimorfismo del gen 26S rRNA 28 Conclusión

29 El cuadro general de la población de K. marxianus aisladas en Pecorino di Farindola muestra una alta biodiversidad en los niveles genéticos y fenotípicos que potencialmente ofrece muchas oportunidades para nuevo y avanzado conocimiento a nivel de especies tales como proporciona un buen material para estudiar la relación entre la variación genética y diversidades funcionales. 29 Conclusión

30 Tofalo, R., Fasoli, G., Schirone, M., Perpetuini, G., Pepe, A., Corsetti, A., & Suzzi, G. (2014). The predominance, biodiversity and biotechnological properties of Kluyveromyces marxianus in the production of Pecorino di Farindola cheese. International journal of food microbiology, 187, 41-49. 30