DNA MITOCONDRIAL EN NÚCLEOS DE HEPATOCITOS DE RATA OBSERVADO CON FISH Mónica González-Sánchez, María J Puertas, Miriam González-García Dpto. de Genética.

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1 DNA MITOCONDRIAL EN NÚCLEOS DE HEPATOCITOS DE RATA OBSERVADO CON FISH Mónica González-Sánchez, María J Puertas, Miriam González-García Dpto. de Genética Facultad de Biología Universidad Complutense de Madrid

2 Introducción ▪En el núcleo eucariota existen secuencias homólogas al DNAmt Teoría endosimbiótica (L. Margulis, 1967) ▪Lough y col., 2008: El DNAmt se incorpora y se elimina del genoma de maíz de forma continua. ▪Las inserciones de DNAmt en el núcleo pueden están relacionadas con procesos neoplásicos y envejecimiento.

3 Introducción Objetivo: detectar mediante FISH la presencia de DNAmt en el núcleo de hepatocitos pertenecientes a ratas jóvenes y viejas. ▪Mozzhukhina y col, 1994: acumulación de secuencias de DNAmt en regiones activas en transcripción de DNA nuclear en hepatocitos de ratas viejas. ▪Shay y Werbin, 1992: 100 copias de DNAmt en células HeLa (10% en genes estructurales)

4 Jóvenes (4-5 meses) Viejas (35-36 meses) Perfusión con colagenasa (Romero y Viña, 1983) Gradiente de Percoll Hepatocitos inviables y otras células Hepatocitos viables Aislamiento de los hepatocitos Fijación en Formaldehído 4% Realización de las preparaciones

5 Hibridación in situ con fluorescencia (FISH) Jóvenes Viejas (TTAGGG) n 2 ng/ml ADNmt Telómeros ADNmt Telómeros (TTAGGG) n 2 ng/ml Image J (National Institute of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij)

6 Tamaño e intensidad de los núcleos Jóvenes Viejas JóvenesViejos Nº núcleos analizados180173 Área (µm2)218,5 + 5,8247,6 + 6,1*** Intensidad2 x10 7 + 1,4x10 6 2,7 x10 7 + 1,1x10 6 *** ROI Área en px 2 Intensidad (0-65.535)

7 Señales de ADNmt y teloméricas 0,38 µm ADNmt Telómeros ADNmt 0,38 µm Telómeros

8 Tamaño, intensidad y nº de señales de ADNmt ADNmt Volumen px 3 Área px 2 Coeficiente correlación= 0,992 Selección señales ADNmt

9 Tamaño, intensidad y nº de señales de ADNmt JóvenesViejos Señales ADNmt analizadas22002117 Área (µm2)0,88 + 0,021,00 + 0,02*** Intensidad27.366 + 72033.614 + 820*** JóvenesViejos Nº núcleos analizados161163 Nº señales ADNmt/N13,65 + 0,313,69 + 0,3n.s.

10 Tamaño, intensidad y nº de señales teloméricas TelómerosSelección señales teloméricas

11 JóvenesViejos Nº núcleos analizados50103 Nº señales teloméricas/N39,3 + 2,0136,2 + 1,21n.s. JóvenesViejos Señales ADNmt analizadas17162663 Área (µm2)0,42 + 0,0090,43 + 0,007n.s. Intensidad9.203 + 2979.287 + 245n.s. Tamaño, intensidad y nº de señales teloméricas

12 Discusión ▪El DNAmt se inserta en lugares determinados del núcleo. ▪La cantidad de DNAmt en el núcleo aumenta con la edad. ▪El aumento de tamaño de las señales de DNAmt en los núcleos viejos no se debe a poliploidía o endorreduplicación. ▪El método de medida utilizado subestima en nº real de señales. ▪Otras secuencias de DNA nuclear pueden estar amplificándose. ▪¿ Amplificación del DNAmt presente en el núcleo o migración de secuencias desde la mitocondria?

13 Gustavo Barja Chechu Puertas Miriam González Mónica González José Gómez Facultad de Biología Universidad Complutense de Madrid Falta Pilar Caro Departamento de Fisiología Facultad de Farmacia Universitat de València Juán Sastre José Viña Alessandro Arduini Consuelo Borrás