Actualización en determinación de anticuerpos por Luminex

Presentación del tema: "Actualización en determinación de anticuerpos por Luminex"— Transcripción de la presentación:

1 Actualización en determinación de anticuerpos por Luminex
Medición de niveles de anticuerpos en el laboratorio – MFI TM MSc Marcelo Lopez Sección Histocompatibilidad Subdepartamento de Enfermedades No Transmisibles

2 Línea de Tiempo 1969 Patel y Terasaki : Crossmatch citotoxico (XM-CDC) 80’ y 90’ XM Citometria Flujo y los ensayos en fase solida: ELISA 2000 tecnologia X-MAP (Luminex) Para introducirlos es necesario que veamos brevemente algo de historia ,historia que comenzo por el año 69 cuando patel y terasaki describen y publican la metodologia de de crossmatch como prueba previa e indispensable en el trasplante renal de modo de evitar el rechazo hiperagudo…esta metodologia aunque tien una baja sensibilidad y baja especificidad sigue vigente hasta el dia de hoy y de hecho es el metodo que define que receptor va Tx y quien no par un determinado donante…. Poseriormente se le introdujeron algunas mejoras tecnica continuo siendo “ la prueba” en el campo de histocompatibilidad…. Durante los 80 con el desarrollo de la citometria , esta se introduce fuerte como herramienta en los 90 junto con la tecnica ELISA … los llamados ensayos en fase solida que aumentan los limites de la sensibilidad y especificidad se usan conjuntamente con el XM-CDC y estas fueron la s metodolgias que dominaron el mundo y que predominaron hasta entrados los dos mil … momento en que hace su aparición Luminex cuyo vedadero nombre metodologico es tecnologia X-Map que se refiere a un ensayo multiplexeado en donde en una misma mezclade reacccion se pueden medir multiples analitos con gran sensibilidad y especificidad

3 Luminex En que consiste luminex? Es una mezcla de 100 esferas de poliestireno donde cada una de estas esferas ( beads) esta teñida con una mezcla de dos colorantes que para cad una de esas cien bead esta en una definida proporcion que no se repite en ninguna otra…. Esto permite que el equipo discrimine cada una de esta bead…. Ahora si acada bead le pegamos un analito definido como porejemplo un antigeno HLA y si nuestra intencion es buscar anticuerpos anti HLA la union de l Ac al Ag HLA la podemos visualizar con un anticuerpos secundario que a su vez esta teñido con un fluorocromo que tambien es detectado por e el equipo.. La gracia de esto es que tenemos todas estas reacciones en una sola mezcla y de una vez

4 Luminex Tipificacion de antigenos HLA
Identificacion de anticuerpos anti HLA Como ven aquí en este equema simplificado las bead quvan pasando una a una como en fila india y que van siendo incididas por ambos laser que tiene el equipo diciendonos por ejemplo que la bead N° 1 que tiene el Ag x esta negativa para anticuerpos especcifico pero que la bead N° 12 con el Ag Y si esta positiva por lo que la muestra tiene anticuerpos contra ese det Ag…. En Histocompatibilidad este equipo tien prestaciones tanto para la definicion de Ac anti HLA A, B ,C,DR DP, DQ, MICA, MICB como para tipificacion molecular de baja , media y alta definicion next

5 Estudio con Antígenos Individuales
Una Vez que nosotros hemos analizado una muestra de un determinado paciente el equipo nos muestra esta grafica en donde se aprecian la bead categorizadas por los diferentes antigenos Hla .. Asi se puedn tambien aprecioar los valores de MFI

6 Estudio con Antígenos Individuales
Tambien de esta forma podemos apreciar la pantalla de analisis propiamente tal… en donde se disponen las beads ordenadas por la fuerza de la señal llamese MFI bruta aca la ordenado los antigenos cada uno por bead, por este lado los criterios que definen si una bead es positiva… de color rojo… en amarillolo los que califican como debiles … en verde los negativos en este lado el resumen de los pósitivos con su respectiva MFI neta que el valor que nosotros les informamos…. Obviamente esto requiere de un analisis pues para llegar a validar estos resultados ya se manteniendo lo que elequipo asigna o descartando anticuerpos

7 MFI: Median Fluorescence Intensity
Raw Value = MFI bruta BCM = MFI neta MFI normalizada MFI estandarizada (SFI) MFI expresada como MESF MFI expresada como proporción (ratio) Como expresamos los datos que se obtienen de luminex.. Atraves de la MFI que es simplemente la intensidad de la mediana de fluorescencia y que el software de analisis le asigna un valor de acuerdo a la cuentas de fluorescencia que emiten las bead y como esa fluorescencia depende de la cantidad de anticuerpos unido al antigeno que esta pegado en la bead … mientras mas fluorescencia halla mas anticuerpo especifico presente……. Uds. Encontraran en la literatura diferentes formas de expresion de esta MFI (leer) en fin diferentes calculos y adecuaciones que intentan establecer la mas adecuada forma de expresion y comparacion de esta unidad… sin embargo en el trancurso de la presentacion esta busqueda de la perfecta expresion de este valor ha sido mas un obstaculo que un beneficio. Debo señalarles que aunque parezca un dato al margen es el cuento de los proveedores de los reactivos de luminex para Histocompatibilidad… Gen probe y On lambda… nosotros usamos gen probe … ha dado buenos resultados… si Uds me preguntan cual es mejor no hay forma de responder a eso de manera objetiva ( relatar del Coca y Pepsi) lOne lambda tiene la gracia que fue fundada por Terasaki y ese prestigio tiende a asignarsele tambien a los reactivos. Gen probe por otro lado no lo hace nada de mal. Pero sus datos no son comparables y tenemos todo nuestra data de cuatro años en base a este proveedor

8 Anticuerpos anti HLA Vacunas No se presentan en forma natural Terasaki
Trasplante, Embarazo, Transfusiones Vacunas Infecciones bacterianas, virales, fúngicas ¿Durante el periodo fetal? Epitopos Publicos y Privados Epitopos publicos son diferentes secuencias aa Epitopo de la molecula HLA Terasaki “Analisis de epitopos” Duquesnoy “HLAMatchmaker” Recordemos brevemente que son los Ac anti HLA… habitualmente no se presentan en forma natural los principales eventos sensibilizantes son los Tx (nadie mejor que Uds podrian saberlo)… los embarazos cerca del 25 de ellos termina con produccion de anticuerpos anti HLA marido, tranfusione s tambien son un importante elemento sesibilizante…. Tambien se han descritos en vacunacion, o como producto de infecciones bacterianas , fungicas, virales…. Algunos trabajos les restan importancia, los decriben como transitorios , incluso los definen como anticuerpos dirigidos a moleculas HLA denaturadas. Es decir moleculas que han perdido du estructura terciara Y/o secunadria y exponen epitopos que normalmente no se encuentran disponibles sobre la superficie celular… esto esta todavia en discusion. Hay algunos que teorizan que parte de estos anti HLA “naturales” estaria dado por contacto con antigenos maternos durante la vida fetal…. Las moleculas HLA poseen multiples epitopos y estan son las regiones que son reconocidas por los anticuerpos anti HLA… si estos epitopos son privados este anticuerpos estara reconociendo un determinado alelo HLA … si es publico es entonces un epitopo que es compartido por varios antigenos HLA y de aquí se desprende la descripcion que en un primer momento hizo la serologia de anticuerpos anti HLA de reaccion cruzada y que hoy en dia se ha demostrado que esto epitopos corresponden a distintas secuencias AA lineares o conformacionales conclusiones que en frma separada a sacado Terasaki en su trabajo empirico de analisis d epitopos y por otro lado Duchesnoy en el matchmaker

9 Anticuerpos anti HLA en Luminex
CDC Gold Standard Poco sensible y poco especifica Citometria Crossmatch Muy sensible, poco especifica Luminex Acuciosa identificacion Ac Muy sensible, muy especifica Histocompatibilidad del ISP Screening Pool Ag HLA Clase I Pool Ag HLA Clase II Especificidad Diplotipo 2A 2B 2C Diplotipo 2DR 2DQ 2DP Single Ag HLA A, B, C Ag HLA DR, DQ, DR Ya entrando de lleno y definitivamente al mundo de los anticuerpos anti HLA en Luminex… nosotros en el lab tenemos las tres metodologias que Uds aprecian en estos trapezoides CDC..que sigue siendo el Gold Standard a pesar de ser poco sensible y poco especifica… la citometria de flujo … enfocada en lo que es XM muy sensible pero poco especifica … y finalmente luminex que nos proporciona una cuciosa identificacion de Ac siendo muy muy sensible y muy especifica… tanto que se le acusa de ver de mas…… en cuanto a los ensayos que tenemos disponibles tenemos el screening de anticuerpos en donde tenemos pooles de antigenos clase I y Pooles de antigenos clase II distribuidos en un total de 12 beads y los resultados que arrojan son solo cualitativos es decir positivo o negativo para clase I y/o II…. Tenemos el single o tambien conocido como antigenos individuales en donde alrededor de 93 antigenos clase I y 65 antigenos clase II cada uno adherido a una bead por lo que si se encuentra en el suero el anticuerpo especifico al antigeno este se unira a la molecula y nosotros podremos cuantificar ese grado de unión obteniendo de MFI una idea bastante exacta de la fuerza o titulo de ese anticuerpo… este tercer ensayo que me salte ex profeso es una metodologia intermedia que arroja resultados confiables a la hora de definir anticuerpos especificos pero siendo mucho menos preciso que el single y mayormente se ocupa cuando tenemos interferencias por reactividad oinespecifica en el single es decir nos ayuda. Este ensayo consta en cada bead de un diplotipo clase I o clase II según sea el kit que estemos usando.

10 Anticuerpos anti HLA en Luminex
Ventajas Discrimina entre anticuerpos anti HLA clase I y II Detecta Anticuerpos fijadores y no fijadores de complemento Permite análisis complejos perfiles de anticuerpos en pacientes hipersensibilizados Otorga la posibilidad de definir mismatch aceptable y no aceptables “Crossmatch Virtual” Eficaz herramienta monitoreo post trasplante Si miramos las ventajas que ofrece luminex es que discrimina los anticuerpos anti HLA de clase I y II tan acuciosamente que difinitivamente es infinitamente superior CDC y algunos autores le entregan tambien una superioridad sobre la citometria de hecho el principio de funcionamiento de luminex esta basado en la ciometria de flujo… nos permite detectar anticuerpos fijadores y no fijadores de complemento. Nos permite cuantificar la reactividad o fuerza de un anticuerpos´es decir su titulo … permite el anlisis de complejos perfiles de anticuerpos de pacientes hipersensibilizados situacion que antiguaente era muy dificil para estos pacientes. Por ende otorga la la posibilidad de de definir mismatch aceptables y no aceptables es decir realizar un XM virtual y e ha constituido no solo una eficaz herramienta para el pre tX sino como tambien en el monitereo pos TX

11 Anticuerpos anti HLA en Luminex
Desventajas La cantidad de antígeno por bead Alteración conformación estructural del Ag Interferentes en el suero del receptor (IgM, Campath) Variación entre ensayos, entre laboratorios, entre lotes. Solo dos proveedores. One Lambda y Gen-probe. Falta de consenso en la forma de calculo y expresión El alto nivel de sensibilidad ≠ Relevancia Clinica Como toda metodologia tiene tambien sus complicaciones y/o desventajas.. La cantidad de antigeno por bead pudiera no ser representativa de la existente en en la superficie celular y ante eventuales concentraciones moderadas o bajas de anticuerpo nos de señal de un alto titulo… en general los proveedores otorgan la forma de hacer la adecuacione s pertinente y normalizar esta c concentracion y por ende la señal. El hecho que se extraigan los Ag de la superficie celular y se peguen a la bead pudiera estar denaturando en algunos casos estas moleculas que finalmente podrian no ser reconocidas por el anticuerpo especifico dando una señal falsamente negativa o bien ser reconocida por anticuerpos irrelevantes danto en este caso una señal falsamente positiva. La presencia de anticuerpos de tipo heterofilo ya sean IgG o IgM que reconozcan y se unan a las moleculas adheridas a la bead o inclusive al mismo material del que estan fabricadas son interfernte que provocan respuestas falsas negativas y falsas positivas… tambien los proveedores entregan algunas herrramientas que nos permite detectar y evadir reacciones inespecificas… Tambien algunos farnacos con estructura biologica tienen esa capacidad de interferir. Otra limitante que no es propia de la metodologia en si pero si de su ejecucion es la variacion entre ensayos, entre laboratorios entre lotes de reactivo… la existencia de solo dos grandes proveedores OL y Gen probe complica el panorama y mas adelante sabran porque … Como ya le mencionaba antes la falta de consenso en la forma de calculo y de expresion en el manejo del dato que nos entrega el equipo hace casi imposible definir en base a la literatura una forma unica que conteste a las preguntas que surge y una y quizas la principal pregunta tiene que ver con esa caracteristica de la que nos jactabamos … su alta sensibilidad nos hace ver demas? Son estos rebuscados anticuerpos relevantes clinicamente? Surge por ende la necesidad e establecer un punto de corte que a Uds les permita trasplantar con un margen de seguridad aun asi se hallan definido ADE.

12 Anticuerpos anti HLA en Luminex Laboratorio de Histocompatibilidad
Definir su existencia Screening , Especif y Single MFI>500 MFI = Acs debiles MFI > 1500 Acs positivos Correlacion con CDC y Citometria MFI ≈ XM CDC positivo MFI ≈ XM Citometria positivo La significancia Clínica Cada Laboratorio define Falta de consenso en el analisis Es complejo El Laboratorio De Histo… que hace? Nosotros definimos para cada una de las metodologias que tenemos el valor que le otorga la existencia o no a un anticuerpo… con 500 mfi el anticuerpo existe y de ese valor hacia arriba.. No se olviden que definirlo asi significa que uno asume que existe uno o mas clones de linfocitos B de memoria que daran cuenta de una rapida respuesta de IgG la proxima vez entre en contacto con el antigeno. Ahora, uno cada vez que asigna una especificidad, entiendase mismatch no aceptable esta definiendo de por vida que es lo que a ese se le puede ofrecer y que es lo que no Por otra parte es imprescindible establecer la correlaciones con las demas metodologias de analisis con la intención de unir fuerzas entre ellas para una mejor descripcion del fenomeno inmunologico y repitiendo la sabida verdad de que una sola metodologia no puede explicarlo todo por lo que la busqueda de la complementaridad se hace necesaria……….. Como ven aquí y bien preliminarmente, pues es un estudio en desarrollo con alrededor de 4000 mil MFI podriamos tener un CDC Positivo y con alrededor de 2000 mil MFI un Xm por citometria positivo. Reitero estas aproximaciones pudiesen cambiar. Otro detalle importante el la significancia clinica que tienen estos anticuerpos y esto en directa relacion con su fuerza o titulo. tambien entiendase MFI y en esto ha sido muy dificil que los diferentes grupos alrededor del mundo se pongan de acuerdo. Como les decia yo antes una enorme falta de consenso en el analisis y forma de estas MFI nos obliga a tener que definir localmente estos parametros

13 Anticuerpos anti HLA en Luminex
Pretrasplante Relevancia Clínica de los Anticuerpos anti HLA Donante Específicos (ADE) en el Pretrasplante Cutoff 500 – 6000 MFI Receptores Tx con ADE de bajo titulo altas tasas de rechazo agudo pero no una peor sobrevida del injerto Receptores Tx con ADE altas tasas rechazo agudo y peor sobrevida del injerto -Receptores -Rangos PRA -protocolos preTx -Cutoff -Analisis Datos -Proveedor No es extraño que hallemos en la literatura trabajos que definen el valor clinico en MFI de un ADE en el preTx en rango que va desde la 500 a 6000 MFI y no solo eso sino que extrapolan de los resultados aseveraciones muy distintas …solo por citar grupos que describen que la presencia de ADE en pacientes TX con XMCDC negativot tienen una lata tasa de rechazo agudo pero no una peor sobrevida del injerto cuando se les compara con una cohorte de pacientes Tx con XMCDC negativos y presencia preTx de anticuerpos no ADE.. En cambio otro grupos encuentra que ambas variables rechazo agudo y sobrevidase ve afectadas negativamente…..De que dependen estas diferencias… pues de vario factores Categorizacion de lo pacientes, sus rangos de PARA, protocolos clinico preTx,,Cutoff o valñor de corte que calculan el como lo calculan en el analisis de datos , influye tambien el tipo de proveedor usado y por ende el tipo de Kit

14 Anticuerpos anti HLA en Luminex
Diferentes Cutoff en la definicion de Anticuerpos Aubert V, Venetz JP, Pantaleo G, Pascual M. Low levels of human leukocyte antigen donor-specific antibodies detected by solid phase assay before transplantation are frequently clinically irrelevant. Hum Immunol 2009;70: Everly MJ, Rebellato LM, Ozawa M, Briley KP, Catrou PG, Haisch GE, Terasaki PI. Beyond histology:lowering human leukocyte antigen antibody to improve renal allograft survival in acute rejection.Transplantation 2010;89: Morris GP, Phelan DL, Jendrisak MD, Mohanakumar T. Virtual crossmatch by identification of donorspecific anti-human leukocyte antigen antibodies by solidphase immunoassay: a 30-month analysis in living donor kidney transplantation. Hum Immunol 2010;71: Higgins R, Hathaway M, Lowe D, Lam F, Kashi H, Tan LC, Imray C, Fletcher S, Zhender D, Chen K, Krishnan N, Hamer R, Briggs D. Blood levels of donor-specific human leukocyte antigen antibodies after renal transplantation: resolution of rejection in the presence of circulating donor-specific antibodies. Transplantation 2007;84: Akalin E, Dinavati R, Friedlander R, Ames S, de Boccardo G, Sengal V, Schroppel B, Bhaskaran M, Lerner S, Fotino M, Murphy B, Bromberg JS. Addition of plasmapheresis decreases the incidence of acute antibody-mediated rejection in sensitized patients with strong donor-specific antibodies. Clin J Am SocNephrol 2008;3: Zachary A, Sholander JT, Houp JA, Leffell MS. Using real data for a virtual crossmatch. Hum Immunol 2009;70:574-9. Bueno aquí tienen Uds algunos trabajos que citan diferentes valores de cortes en la definicion del valor clinico de la MFI de un ADE y de cómo este valor incide en sus estudios

15 Valores de Positividad anticuerpos anti HLA
Aquí me he permitido citar una tabla de un trabajo muy intereante realizados por la DRAs Pefaur y Elgueta y en donde se describe mas detalladamente que la mencion que hice en la diapo anterior los diferentes cutoff de los diferentes grupos de estudio y en algunos se ven las asociaciones que se hacen con otras metodologias como po rejemplo…(describir) REV. MED. CLIN. CONDES ; 21(2) 239 – 247 DRA. JACQUELINE PEFAUR P. Y COL.

16 ¿Como definir significancia clínica de un Anticuerpo?
¿Establecer la relaciones entre MFI (Single) y el XM por Citometría? =NO ¿Establecer la relaciones entre MFI (Single) y el XM por CDC? XM CDC es el Gold Standard en evitar rechazo hiperagudo…¿Quien trasplantaría con XM CDC positivo?…. Chang Liu et al, Human Immunology 73 (2012) …. Utilizan MFI, MR y RR Para anticuerpos anti A, B y DR = 2685 MFI Para anticuerpos anti DQ = MFI

17 Definicion de significancia clínica: considerar
Fuerza de un anticuerpo Tipo de análisis ¿Cuando existan mas de un ADE? “efecto aditivo de dos o mas ADE” La afinidad por el antígeno La capacidad de fijar o no complemento. IgG1, IgG IgG2, IgG4 Valor de los anti C y anti DP “Anticuerpos naturales” anti HLA

18 Anticuerpos anti HLA en el post-trasplante
Deteccion Son anticuerpos “De Novo” Aparecen antes de la alteración de la función renal Tiempos de aparicion… variables…50 dias Elemento predictor de la falla del injerto ADE post-trasplante Pac preTx ADE y XMCDC negativos=25 % ADE post Ligeramente mayor frecuencia de anti clase II (DQ) Su persistencia >1 año = peor evolución clínica Considerar ADE transitorios no afectarían sobrevida injerto Correlacionar con variables clínicas No detección o bajo niveles …. ¿absorbidos al injerto? Monitoreo post-trasplante Hastael momento habiamos visto estos Ac en el preTX… veamos que hay connesta nueva dinamica de medicion de anticuerpos en el post TX y que ha ido en crescendo en elos dos ultimos años… De la definiciones que uno puede mencionar esque son anticuerpos de Novo es decior su generacion esta estimulada por la Antigenos HLA del injerto.. Existe clatridad que aprecen antes incluso de la falla funcional del injerto… sus tiempos de apricion son variables alguno trabajo tieneden a situar la mediana alrededor de los 50 dias post Tx y en gneral existe consenso que su paricionconstiutuye un elemneto predictosr de la falla del imjerto. Si se quiere mirar en que porcentaje de pacientes alguno trabajos indican que alrededor del 25% en pacientes que era ADE y XM cdc negativvos

19 Anticuerpos anti HLA en Luminex
Pre-trasplante Post- trasplante MFI son menos preocupantes en pacientes sin eventos de sensibilización MFI Monitoreo/Reingreso siempre hay que considerar Pacientes con historia embarazos o transfusión Hay que considerarlos En pacientes que reingresan sin anticuerpos detectables y sin tipificaciones HLA confiables; injerto in situ Cantidad Persistencia posterior Especificidades

20 Tx Creat Creat 1° Biopsia 2° Biopsia IVIG Rituximab R. Mixto SM IVIG
Nuevamente la creatinina se estabiliza en 1,5 mg/dl aproximadamente por 3 meses. El ADE sigue presente a bajos títulos. No obstante se verifica un nuevo incremento de la creatinina a mediados en el més 12 postTx por lo que se realiza una nueva Bp. El Dr. Contreras presenta de nuevo…… Con el Dx de un nuevo RHA con componente celular recibe tratamiento con SM 3 bolos de 1gr c/ uno y se administra IVIG (2 gr/kg).

21 Estudio con Antígenos Individuales Receptor A2-A24/B14-B60/DR /DR52 Donante A1-A30/B8-B13/DR7-DR17/DR52-53

22 PRA Virtual (vPRA)

23 Preseleccion receptores
Turno Donante Cadáver Donante Cadaver Tipificacion A,B,DR,DQ Crossmatch Virtual Preseleccion receptores XM CDC Seleccion receptores Quiero que recuerden y los que no saben que aprendan que el flujo a continiuacion describe my esquematicamente la secuencia que sigue un DC en el laboratorio de Histo…llega

24

25 Pacientes en lista de espera y trasplantados con PRA>50% y 75%
Porcentaje de pacientes Año

26 Gracias