INTRODUCCIÓN La recombinación consiste en la producción de nuevas combinaciones genéticas a partir de las generadas inicialmente por la mutación. Dos moléculas.

Presentación del tema: "INTRODUCCIÓN La recombinación consiste en la producción de nuevas combinaciones genéticas a partir de las generadas inicialmente por la mutación. Dos moléculas."— Transcripción de la presentación:

1 INTRODUCCIÓN La recombinación consiste en la producción de nuevas combinaciones genéticas a partir de las generadas inicialmente por la mutación. Dos moléculas de ADN que posean distintas mutaciones pueden intercambiar segmentos y dar lugar a la aparición de nuevas combinaciones genéticas. Las bacterias y los virus, al igual que los organismos eurcarióticos también tienen mecanismos de recombinación. En el caso de las bacterias existen tres mecanismos de recombinación: transformación, conjugación y transducción. La existencia de estos mecanismos permite la construcción de mapas genéticos en bacterias.

2 Transformación: en determinadas condiciones fragmentos de ADN exógeno pueden entrar en el interior de las bacterias. El ADN exógeno puede intercambiar segmentos con el ADN del cromosoma principal bacteriano. Conjugación: transferencia del material hereditario (ADN) de una bacteria donadora a otra receptora. Requiere el contacto físico entre las dos estirpes bacterianas, la donadora y la receptora. El contacto físico se establece a través de los pili-F de la bacteria donadora formándose un tubo de conjugación. El ADN de la bacteria receptora puede intercambiar segmentos con el ADN de la donadora. Transducción: no necesita del contacto físico entre dos estirpes bacterianas. El vehículo o vector que transporta ADN de una bacteria a otra es un virus. Al igual que las bacterias, también existen mecanismos que originan recombinación en virus. Cuando dos virus diferentes infectan a la misma bacteria, sus ADNs pueden intercambiar segmentos y, como consecuencia, pueden aparecer partículas virales recombinantes con nuevas combinaciones genéticas.

3 TRANSFORMACIÓN En determinadas condiciones fragmentos de ADN exógeno o ADN transformante (tamaño superior a 3 x 10 5 dalton y longitud comprendida entre 5 x 10 6 y 15 x 10 6, que equivale a 200.000 pares de bases) con estructura helicoidal intacta pueden unirse a células bacterianas competentes y entrar en su interior. La entrada de estos segmentos necesita de la presencia de iones de k +, Mg ++ y Ca ++. El ADN entra en el espacio periplasmático, entre la pared celular y la membrana plasmática, allí una endonucleasas corta las dobles hélices en fragmentos de menor tamaño, posteriormente se degrada una de las dos hélices, de manera que lo que entra en el citiplasma es ADN de una hélice (monocatenario). Estos fragmentos de ADN monocatenario o ADN transformante pueden sustituir a fragmentos de ADN homólogo del cromosoma principal bacteriano mediante un mecanismo especial de recombinación. La recombinación genética tiene lugar entre el ADN transformante y el ADN de la bacteria receptora y se detecta por la aparición de bacterias descendientes transformadas para algún carácter.

4 En bacterias, la transformación refiere a un cambio genético estable producido al incorporar ADN desnudo (ADN sin células o proteínas asociadas), y la competencia refiere al estado de ser capaz de incorporara ADN exógeno del ambiente. Competencia Algunas bacterias (cerca del 1% de todas las especies)son capaces de incorporar de manera natural, ADN bajo condiciones de laboratorio; y muchas mas pueden ser capaces de hacerlo en sus ambientes naturales. Estas especies traen un conjunto de maquinaria genética específica para llevar el ADN a través de la membrana o membranas.

5 Transformación Tipos El ADN transformante, puede ser: ADN de plasmido. El plasmido no se integra en el cromosoma, ya que posee su propio origen de replicación. Se replican en coordinación, cuando se replica, el ADN cromosómico se fragmenta, transformándose tan solo algunos cachos, que luego entrarán en la bacteria receptora. Para que las bacterias sean capaces de introducir ADN en su interior deben estar en estado de competencia; algunos lo poseen de forma natural, pero en general debemos inducirles este estado tratándolas con ClNa, en frío, y sometiéndolas a un choque térmico de 0º-42º. ADN cromosómico. Una bacteria posee receptores donde se acopla el ADN, que se desnaturaliza en sus dos cadenas al entrar, una cadena se asocia con la zona homologa de la bacteria y se degrada por enzimas que hay en las dos cadenas. El ADN se aparea con el cromosoma normal y el otro con el otro con el ADN del híbrido. DIFERENCIA: el ADN entra por unos receptores que deben estar activados; en el ADN cromosómico, podemos usar 2 ó 3 marcadores, el fragmento de ADN que entra tiene de 10-20 kilobases.

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7 TRANSDUCCIÓN Es un mecanismo de recombinación genética en bacterias, que está mediado por un virus bacteriano denominado bacteriófago=fago. En este proceso, la célula dadora es en primer lugar infectada por un fago. Se forma así una partícula viral que está defectuosa, y que contiene parte del ADN del fago y parte del ADN de la bacteria. Ahora, esta partícula viral se llama partícula transductora y es capaz de infectar a una bacteria receptora. De esta manera hay una transmisión de ADN de una bacteria dadora a una bacteria aceptora, a través de un fago. Un fago que infecta a una bacteria forma lo que se denomina partícula viral, que está constituido por una cápsida de proteínas y en su interior está el genoma viral (la mayoría de bacterias tienen ADN de cadena doble). Cuando un fago infecta a una bacteria, tiene lugar lo que se llama el ciclo de replicación viral, cuyo objetivo es la formación de numerosas partículas virales. Este ciclo de replicación viral finaliza normalmente con la lisis de la bacteria. Por eso también se le llama ciclo lítico.

8 Para que un fago infecte a una bacteria, tiene que ocurrir que este fago se una a la superficie de la bacteria. Es una unión específica y está regulada por receptores que se encuentran en la superficie de la bacteria y reconocen de forma específica proteínas de la cápsida. Después de la unión, tiene lugar la penetración del ADN viral. A continuación, el ADN del fago se multiplica dentro de la bacteria, mientras que normalmente el ADN de la bacteria es degradado. Cuando se ha multiplicado el ADN viral, se sintetizan las proteínas de la cápsida del virus. Después, tiene lugar el ensamblaje de las proteínas de la cápsida y el ADN viral, formándose nuevas partículas virales. Finalmente, la bacteria se rompe y se liberan las partículas virales, que pueden volver a infectar nuevas bacterias. Durante el ciclo de reproducción del fago, se forma una partícula defectuosa dentro de la bacteria, que contiene parte del ADN del fago y parte de la bacteria. Se llama a esta partícula, partícula transductora. Esta partícula puede infectar a otras bacterias.

9 Las partícula transductora es defectuosa porque no tiene completo el ADN viral, por lo que al infectar a otra bacteria no se puede reproducir, no tiene información suficiente para todas las partes. Pero las proteínas de la cápsida son normales, por lo que la partícula transductora puede unirse a los receptores de la superficie de la pared de la bacteria e introducir el ADN en su interior (pero es un ADN que no es completo). Con este proceso, la bacteria receptora recibe un fragmento de ADN de una bacteria dadora. Si este fragmento de ADN exógeno es complementario con el del ADN de la bacteria, hay apareamiento y recombinación entre ambas moléculas de ADN.

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11 El ciclo lítico ocurre cuando el material genético del virus (virus virulento) penetra (a,b) en la célula huésped y comienza a fabricar nuevos virus (c,d). Para ello, 1º transcribe genes tempranos que estimulan la replicación del genoma viral. Luego, genes tardíos codifican la síntesis de proteínas para empaquetar el cápside y lisar la célula huésped. Eventualmente los nuevos virus causan la ruptura o lisis (e) de la célula y continúan el ciclo infeccioso (f).

12 La transducción es el fenómeno por el cual una porción del ADN del huésped es transferido de una célula a otra por un virus (ver abajo, fig. a,b,c,e). Algunos bacteriófagos son "temperados" o atenuados dado que tienden a ser lisogénicos mas que líticos. Estos tipos de virus estos virus son capaces de transducir fragmentos de ADN.

13 Transducción generalizada: La degradación del cromosoma bacteriano durante el ciclo lítico, posibilita el que algunos trozos de este cromosoma (siempre que sean de la longitud correcta), sean empaquetados por error dentro de cápsidas víricas, lo que provocará que cuando este fago vuelva a infectar una bacteria, introduzca el fragmento erróneo de cromosoma. Así es como se produce la transducción. Este tipo de fagos se denomina fagos transductantes y los cuales, aunque son minoritarios (1/100000), cuando infectan nuevas bacterias, pueden producir la integración de los marcadores genéticos que llevan en el cromosoma bacteriano receptor y generar bacterias transductantes. Como en la conjugación, estas bacterias recombinantes se producen por doble entrecruzamiento entre el segmento de DNA dador y la región homóloga del cromosoma receptor. El fragmento de DNA introducido en la bacteria es, de, diferente al de la propia bacteria infectada, produciéndose recombinación entre los marcadores, lo que nos lleva a obtener un diploide parcial. Hablamos de transducción generalizada porque teóricamente puede transducirse cualquier fragmento del cromosoma bacteriano.

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15 Transducción especializada: Se da gracias a la acción de algunos fagos que se insertan en regiones concretas del cromosoma bacteriano, de forma que solamente pueden transducir genes que se encuentran alrededor de estos. La escisión posterior suele ser precisa, de forma que suele reconstruirse el fago, pero puede ocurrir que el punto de entrecruzamiento no se de entre las regiones comentadas, sino entre otras, originándose un DNA circular anormal. Puede entonces perderse una parte del cromosoma del fago, pero en cambio se gane un trozo del cromosoma bacteriano. Así obtendremos una progenie de fagos transductantes, los cuales han perdido una parte de los genes esenciales para el establecimiento del ciclo lítico. Estos fagos necesitarán la ayuda de fagos no defectuosos ayudantes, gracias a los cuales suplirán las funciones requeridas para replicarse activamente.

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17 CONJUGACIÓN Es un mecanismo de recombinación en bacterias que requiere el contacto directo entre dos bacterias. Es un proceso polarizado, es decir, siempre va en la misma dirección, por lo que hay células dentro de una población de bacterias que siempre actúan como dadora, F + o Fertilidad +, y luego hay otras que actúan siempre como aceptoras, F - o Fertilidad -. Sólo las células F + contienen un plásmido llamado factor F. Durante la conjugación, tiene lugar la copia y transferencia del factor F desde la célula F + a la F -. Así, al final de la conjugación se obtienen dos bacterias F +, la que era F + sigue conservando el plásmido y la F - se transforma porque adquiere el factor F. Este mecanismo de recombinación en bacterias es muy importante porque también se van a transferir los caracteres genéticos que están codificados en el factor F. Entre los caracteres puede haber en un factor F, se encuentran por ejemplo, los que confieren resistencia a los antibióticos. Así, si un individuo de la población presenta resistencia a los antibióticos, esta proporción se va a extender a toda la población.

18 Las etapas de la conjugación son: - Contactos entre bacterias F + y F - a través de las fimbrias. Los genes para la formación de estas fimbrias, está en el factor F, por lo que sólo van a poder tener estas estructuras las F +. - Movilización del plásmido, que consiste en la rotura de una de las dos cadenas del factor F, en una secuencia determinada. La enzima que corta el ADN es una endonucleasa que también está codificada por el factor F. Una vez que tiene lugar la rotura de la cadena, se da la replicación o duplicación de la cadena que permanece cerrada. Esto causa el desplazamiento de la cadena abierta y que es transferida a la célula receptora a través de la fimbria. Cuando se acaba esto, tenemos que la célula que era F + conserva el factor F completo y la F - ha recibido una cadena del plásmido. Replicación de la cadena transferida. Se rompe el contacto entre las células y al final las bacterias son F +. El factor F tiene una propiedad, se puede integrar en el cromosoma de la bacteria. Así, una bacteria que tiene el factor F integrado en el cromosoma, se dice que es una bacteria Hfr (alta frecuencia de recombinación).

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21 El factor F (de fertilidad) de E. coli es un plásmido presente en las células F+ dadoras (machos) y puede ser transferido a las células F- (hembras) receptoras; estas células pueden transformarse en F+ y transferir, a su vez, el factor F. Cuando el factor F se integra al cromosoma de una célula de E. coli (transformándolas en una célula Hfr), parte del cromosoma o (en raras ocasiones) todo el cromosoma puede ser transferido a otra célula de E. coli por conjugación. En el momento de la transferencia, el cromosoma se replica por el mecanismo de círculo rodante y una copia de DNA de cadena simple entra a la célula receptora linealmente, de modo que los genes bacterianos penetran uno tras otro, en una secuencia fija. Luego se sintetiza la cadena complementaria. Como la velocidad a la cual los genes bacterianos entran en la célula receptora es constante a una temperatura dada, la separación a intervalos regulares de las células que se conjugan permite mapear el cromosoma bacteriano. Una célula F+ se convierte en una célula Hfr cuando el plásmido F se inserta en su cromosoma. Una cadena única de DNA se mueve desde la célula dadora hacia la célula receptora, donde posteriormente se sintetiza su cadena complementaria (líneas punteadas en el cromosoma de la célula receptora

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23 A medida que la cadena de DNA se transfiere, la cadena de la célula dadora "gira" en sentido contrario a las agujas del reloj, exponiendo los nucleótidos desapareados. Éstos sirven como molde para la síntesis de una cadena complementaria de DNA (líneas punteadas, célula dadora). Como resultado, el plásmido en la célula dadora continúa siendo un círculo de DNA de doble cadena y el plásmido transferido convierte a la célula receptora en una célula F+. Este mecanismo de replicación del DNA del plásmido se conoce como "replicación en círculo rodante Una célula F+ se convierte en una célula Hfr cuando el plásmido F se inserta en su cromosoma. Ocurre una ruptura en la secuencia del factor F integrado al cromosoma y comienza la replicación en círculo rodante. Liderada por su extremo 5', una cadena simple de DNA, que contiene una porción de la secuencia del factor F seguida por los genes a+ y b+, penetra en la célula F-. En este ejemplo, sólo una porción del cromosoma se transfiere antes de que las células se separen una de otra. El fragmento de DNA transferido es homólogo a la parte del cromosoma receptor que lleva los mismos genes.

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25 La "concordancia", sin embargo, no es exacta, dado que los genes a- y b- son formas alternativas de los genes a+ y b+. Difieren en la secuencia de nucleótidos como resultado de mutaciones que han hecho, en este ejemplo, que a y b sean no funcionales, o sea, que no den como resultado la síntesis de los productos a y b. Ocurre la recombinación entre el DNA dador y el cromosoma receptor. La célula hija que contenga los genes transferidos a+ y b+ será capaz de sintetizar los productos a y b. Esto ofrece un medio por el cual puede demostrarse la conjugación. Nótese que la célula dadora sigue siendo Hfr y que la célula receptora aún es una F-, al igual que sus células hijas.

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