Espectro Ultravioleta Fenilalanina CHEM 4220-6027: Biochemistry Laboratory Prof. Alberto Vivoni Alonso Ninoshka L. Román Karilia Y. Torres Elizabeth M.

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1 Espectro Ultravioleta Fenilalanina CHEM 4220-6027: Biochemistry Laboratory Prof. Alberto Vivoni Alonso Ninoshka L. Román Karilia Y. Torres Elizabeth M. Morales Carlos Cruz

2 Introducción El determinar la concentración exacta de un analito, es una de las etapas cruciales en cualquier tipo de investigación científica. Para esto se utilizara el análisis espectroscópico ultravioleta. Aqui el analito de concentración desconocida es irradiado con determinado largo de onda de luz y se detectara la cantidad de luz absorbida y transmitida por este. Esta metodología se fundamenta en la Ley de Beer-Lambert la cual es representada por la ecuación A = ɛ cl. Esta ley denota la relación directamente proporcional que existe entre la luz que absorbe la muestra y la concentración molecular de esta, con el propósito de cuantificar la concentración de una solución. Experimentalmente se llevo a cabo el análisis espectroscópico de una muestra de Fenilanina con concentración desconocida utilizando una solución madre y varias diluciones.

3 Objetivos 1.Preparar diluciones partiendo de una solución madre. 2.Determinar la absorbancia de diferentes muestras. 3.Preparar una curva de calibración partiendo del espectro del analito. 4.Confirmar la teoría de la ley de Beer-Lambert mediante el análisis de los resultados.

4 Espectroscopia UV Irradiación de luz UV. Excitación de electrones de un orbital de baja energía a uno de mayor energía. Moléculas absorben la energía. Útil para el estudio de moléculas orgánicas con sistemas π conjugados. Se obtiene el largo de onda (λmax) a la máxima absorbancia de la molécula. Donde; I 0 = intensidad de la luz incidente I = intensidad de la luz transmitida. A= Absorción

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6 Ley Beer-Lambert La técnica de espectroscopia UV tiene diferentes aplicaciones en las moléculas orgánicas en la bioquímica, una de estas es la aplicación de la Ley de Beer-Lambert. La ley de Beer-Lambert se utiliza para determinar la concentración de un cromóforo. Mientras mas grande la absorción de la molécula, mayor concentración. Esta ley se utiliza para calcular la absortividad molar (ε), dividiendo la absorción entre la concentración de la molécula.

7 My Master Creation XD Sistemas π y Aromáticos Sistemas Aromáticos: Átomos sp 2 híbridos. Conformación estable. Enlaces π menos reactivos. Electrones π se deslocalizan alrededor del anillo. Esta deslocalización brinda conformación planar. Conformación proporciona carácteristicas similares a los gases nobles. Sistemas π: Electrones enlazados en orbitales p en pares. Pi enlazante; ambas partes sombreadas juntas. Pi anti-enlazante; orbital de mayor energía que forma nodos entre los núcleos.

8 My Master Creation XD Sistemas π y Aromáticos Molecular orbitals for benzene

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10 My Master Creation XD Fenilalanina La fenilalanina es un amino acido esencial. Uno de los 4 amino ácidos aromaticos; tryptofano, tirosina, histidina y fenilalanina. Se ha encontrado que este tiene un λmax de 258nm y una absortividad molar (ε) máxima de 200.

11 Materiales Fenilalanina 1 matraz volumétrico de 100 mL 3 matraces volumétricos de 50 mL 1 pipeta serológica de 25 mL Botella de lavado de agua destilada Pipeteador Espectroscopio UV Varias cubetas plasticas (pueden ser de cristal o de quarzo) UV-Spectrum

12 Procedimiento 1.Preparación de una solución madre con una concentración de 1.0 mg/mL de Fenilalanina en un matraz volumétrico de 100 mL. 2.Dilución de la solución madre en 25/50, 10/50 y 5/50 en matraces volumétricos de 50 mL. 3.Rastreo en espectofotómetro de UV con un λ entre los 200 y 300 nm con la solución madre para obtener el λ máximo. 4.Medición de la absorbancia al λ máximo de todas las diluciones y la solución madre.

13 Resultados

14 Datos: λ máximo – 255.0 Se pesaron 0.11g ±0.05g de Fenilalanina. 1.31763 – absorbancia de solución madre en espectrofotómetro UV/Vis Tabla 1: Absorbancia de soluciones: Solución/DiluciónAbsorción (UV) Solución madre 1.0 mg/mL1.0703 Dilución 25/500.5539 Dilución 10/500.2525 Dilución 5/500.1591

15 Resultados A la solución madre de la proteína fenilalanina se le determinó un largo de onda máximo de 255.0. Esta solución consta de una concentración de 1.0 mg/mL, y demostró tener una absorbancia de 1.0703 en su largo de onda máximo. Al diluir dicha solución en 25/50, esta solución reporto una absorbancia de 0.5539. Posteriormente la dilución de la solución 10/50, presentó una absorbancia de 0.2525. Finalmente la dilución 5/50 reflejó una absorbancia de 0.1591. En el transcurso de cada dilución se puede observar claramente como la absorbancia de la solución está siendo gravemente afectada por la concentración disminuyendo circunstancialmente. En el caso de la primera dilución (25/50) la absorbancia de la solución sufrió una reducción de 48.25%; en la segunda dilución (10/50) la absorbancia de la solución tuvo una reducción de 76.41%; y en la dilución final de la solución (5/50), la misma tuvo una reducción en su absorbancia de 85.14%. Esta reducción tan marcada, en la absorbancia de la solución, puede ser el resultado de una considerable disminución en el número de moléculas de (Phe) disponibles en la solución para ser excitadas por la luz UV emitida por el instrumento.

16 Resultados

17 Conclusión

18 My Master Creation XD Referencias Reusch, William. (2013). Visible and Ultraviolet Spectroscopy. Recuperado el 21 de abril de 2016 en: http://www2.chemistry.msu.edu/faculty/ reusch/virttxtjml/spectrpy/uv-vis/spectrum.htm Schmid, Franz-Xaver. (2001). Biological Macromolecules: UV-visible Spectrophotometry. Recuperado el 21 de abril de 2016 en: http://www.life.illinois.edu/biochem/455/Lab%20exercises/2Photometry/spectrophotometry.pdf Skoog, D.A., West, D.M., Holler, F.J. & Crouch, S.R. (2014). Fundamentals of Analitycal Chemistry 9E. Molecular Absorption Spectrometry. Page 722. Belmont, CA. Brooks/Cole. Soderberg, Tim. (2015). Section 2.2: Molecular orbital hteory: conjugation and aromaticity. ChemWiki: Organic Chemistry with a Biological Emphasis. Recuperado el 21 de abril de 2016 en: http://chemwiki.ucdavis.edu/Core /Organic_Chemistry/Organic_Chemistry_With_a_Biological_Emphasis/Chapter_02%3A_Introduction_to_organic_structur e_and_bonding_II/Section_2.2%3A_Molecular_orbital_theory%3A_conjugation_and_aromaticity Soderberg, Tim. (2015). Section 4.3: Ultraviolet and visible spectroscopy. ChemWiki: Organic Chemistry with a Biological Emphasis. Recuperado el 21 de abril de 2016 en: http://chemwiki.ucdavis.edu/Core/Organic_ Chemistry/Organic_Chemistry_With_a_Biological_Emphasis/Chapter_04%3A_Structure_Determination_I/Section_4.3%3 A_Ultraviolet_and_visible_spectroscopy Soderberg, Tim. (2015). Section 13.18: The Beer-Lambert law. ChemWiki: Organic Chemistry with a Biological Emphasis. Recuperado el 21 de abril de 2016 en: http://chemwiki.ucdavis.edu/Textbook_Maps/Organic_ Chemistry_Textbook_Maps/Map%3A_Organic_Chemistry_(Bruice)/13%3A_Mass_Spectrometry,_Infrared_Spectroscopy, _and_Ultraviolet%2F%2FVisible_Spectroscopy/13.18%3A_The_Beer-Lambert_Law