Grupo de Trabajo: Unidad Microbiología Molecular-Departamento de BIOGEM- Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable Avenida Italia 3318.

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1 Grupo de Trabajo: Unidad Microbiología Molecular-Departamento de BIOGEM- Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable Avenida Italia 3318

2 Líneas de trabajo asociadas a Biorefinería: Optimización de la producción de bioplásticos de origen microbiano (polihidroxialcanoatos, PHAs), usando hemicelulosa como fuente de carbono Producción de bioetanol de 2 da generación: diseño de una cepa de Saccharomyces cerevisiae capaz de fermentar xilosa-glucosa de forma eficiente.

3 Capacidades humanas de la institución Ana Inés Catalán Ana Karen Malán Alejandra Fagúndez Natalia Carbó Silvia Batista

4 Colaboración con instituciones nacionales Facultad de Ingeniería, UdelaR Verónica Saravia Guadalupe Martínez Mairan Guigou Claudia Lareo Facultad de Química, UdelaR Fernando Ferreira

5 Colaboración con instituciones de la región Instituto de Ciencias Biomédicas, Universidad de San Pablo Gregorio Cabrera Gómez Universidad de Paraná, Curitiba Emanuel de Souza

6 Capacidades técnicas Laboratorio con equipamiento para microbiología, biología molecular y determinaciones analíticas Cámaras de flujo Autoclaves Estufas de cultivo Equipos de PCR, equipos de electroforesis y visualización de geles Centrífugas refrigeradas, freezer, cuarto frío GC-MS (institucional); GC-FID

7 Proyectos en ejecución Recientemente finalizados “Aplicación de la ingeniería metabólica para la producción de polihidroxialcanoatos por Herbaspirillum seropedicae Z69 apartir de hemicelulosa residual”. ANII-FSE-1-2009-46. 2010-1012 Responsable: Dra. Beatriz Mendez. “Optimización de procesos industriales para la obtención de bioplásticos y otros productos” CYTED Area 3: Promoción del desarrollo industrial. P309RT0120. 2010-2012 En curso “Diseño y evaluación de cepas de Saccharomyces cerevisiae modificadas para co-fermentar xilosa y glucosa a etanol a partir de material lignocelulósico”. ANII FSE_1_2014_1_102664. 2015-2017

8 “Diseño y evaluación de cepas de Saccharomyces cerevisiae modificadas para co-fermentar xilosa y glucosa a etanol a partir de material lignocelulósico” Obtener una cepa de Saccharomyces cerevisiae capaz de fermentar el hidrolizado de celulosa y hemicelulosa a la formación de etanol El objetivo particular del proyecto es obtener un conjunto de organismos modificados a partir de tres cepas de S. cerevisiae de partida, en genes relacionados con la fermentación de xilosa a etanol, capaces de crecer y producir etanol al ser cultivadas en un medio base empleando xilosa y la mezcla xilosa-glucosa como fuente de carbono.

9 Cepas en uso Cepas comerciales CAT1 cedida por ALUR, comercializada por Fermentec (Brasil) CCTCC M94055 (Angel Yeast Co., China) Cepas haploides de laboratorio BY4741 aporte del IP Montevideo

10 Consideraciones a tener en cuenta Las cepas industriales son diploides y no se dispone de sus genomas secuenciados (público?) Se debe trabajar con vectores tipo shuttle capaces de replicarse en procariotas y levaduras Pocos antibióticos y caros (en gral. se introducen marcadores de auxotrofía)(no es una opción en este caso) Nos proponemos expresar genes heterólogos de interés Sistema de recombinación permite incorporación de ADN lineal

11 Vías introducidas Vía oxo-reductivaVía de xilosa isomerasa

12 Organismos seleccionados

13 Modificaciones introducidas Se introdujeron las construcciones en el gen GRE3 (XR) de S. cerevisiae Se introdujeron genes XR y XDH de S. stipitis optimizados para la levadura. XR contiene además un amino ácido modificado en posición 270 Se introdujeron copias extra de genes XK y TAL1 de PP Se introdujo gen de transporte de hexosas modificado con alta afinidad por xilosa Se introdujo copia del gen XI

14 Evaluar fenotípicamente los transformantes seleccionados para determinar el crecimiento en xilosa y mezcla xilosa- glucosa y actividades enzimáticas. Verificar sitio de inserción mediante PCR y ausencia de GRE3 Ensayo de adaptación evolutiva mediante sucesivos repiques limitados en oxígeno para seleccionar los mejores adaptados a crecer en xilosa Determinar crecimiento y producción de etanol en ensayos en batch limitados en oxígeno Actividades en curso

15 Gracias!