LA ERA DE LA GENÓMICA 1960… informática + biología computacional 1986 “Genómica” Métodos de secuenciado. 1977: Sanger (sec. ФX174) y Maxam-Gilbert (Nobel 1980) C. Woese: ARNr16S: Archae Síntesis de la hormona de crecimiento humana (somatostatina) y expresión en E. coli. S. Anderson. Secuenciado del mtADN (1981) K.B. Mullis. PCR en 1983. (Nobel 1993) (Hood. Secuenciado automático por fluorescencia 1986). 1989. HUGO: Human Genome Organization 1990. Brenner. Secuenciado del cADN de los genes humanos. Secuenciado por electroforesis capilar (Smith-Karger-Dovichi) Lipman y Myers: BLAST (basic local alignment) algoritmo para alinear secuencias 1994 Wilkins: “Proteoma” 1995. Venter. Secuencia de Haemophilus influenzae (1.8 Mb) Brown: primer microarray de cADN sobre vidrio 1996. Venter. Secuenciado de M. jannaschii(1.7 Mb) Oliver: Primer genoma eucariota secuenciado: Saccharomyces cerevisiae (12.1Mb) 1997. Wilmut. Clonado de Dolly. Blattner: secuencia completa de Escherichia coli (4.6 Mb) 2000. Adams y Myers. Secuenciado de Drosophila melanogaster (137 Mb) 2002. Holt. Secuencia del mosquito de la malaria, Anopheles gambiae (278 Mb) 2004. Secuencia completa del genoma humano

Avances biología molecular + bionformática +Internet + Genómica: LA ERA POSTGENÓMICA PROTEÓMICA, etc Capaz esto puede engancharse con las “moléculas de la vida”, organización celular procariota vs eucariota y luego arrancar directamente con los dos genomas (señalando sus mayores diferencias a nivel organizativo) Habría que incluir algo de eucariotas

GENÓMICA: mapeo, secuenciación y análisis de genomas

GENOMA PROCARIOTA Cromosoma Plásmidos Virus Elementos genéticos móviles

Cromosoma “nucleoide” DNA doble cadena Rango de tamaños: ~750 kb in Mycoplasma spp 5000 kb (5 Mb) en Escherichia coli 10 Mb en Streptomyces spp

Número: Cromosoma Generalmente un cromosoma, pero algunas especies tienen dos cromosomas…. Burkholderia pseudomallei (3.6 and 2.4 Mb) Rhodobacter spheroides (3 and 1Mb) MEGAPLÁSMIDOS? MINICROMOSOMAS?

Generalmente ADN circular y superenrollado ( en contraposición a los cromosomas eucariotas lineales) Ej: E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae pero… lineales en algunas especies de Streptomyces y Agrobacterium, espiroquetas y Borrelia burgdorferi Cromosoma Como dije antes, quizas el comparativo con cromosomas eucariotas tendría que ser mas amplio, incluir mas datos de los eucariotas.

Annu.Rev. Genet.2004. 38: 771-791. Bentley and Parkhill

Cromosoma Proteínas asociadas al cromosoma, proteínas ‘pseudo-histonas’ o proteínas ‘asociadas al nucleoide’ Ej:. HU de Escherichia coli, 40,000 moléculas/cél (aprox. 1 molécula/100 pb de ADN) involucradas en empaquetar el cromosoma, regular la transcripción

Plásmidos Material genético estable, replicación independiente, la mayoría ADN circular doble cadena superenrollado pero… plásmidos lineales en Streptomyces, Borrelia burgdorferi plásmidos simple-hebra de ADN en Myxococcus xanthus

Número de copias de plásmido: Plásmidos Plásmidos Número de copias de plásmido: Plásmidos pequeños (5-10 kb) 50-100 copias/cél (1000 en algunos plásmidos de Streptomyces) plásmidos grandes (50-200 kb) 1-10 copias/cél -Limitado rango de hospederos -Algunos plásmidos ‘promiscuos’ de amplio rango de hospederos

resistencia a antibióticos : - degradación enzimática (penicilina) Plásmidos Los plásmidos son elementos genéticos accesorios y codifican para funciones adaptativas: conjugación resistencia a antibióticos : - degradación enzimática (penicilina) - modificación enzimática (cloranfenicol) - permeabilidad alterada en membranas (tetraciclina) - alteración de la diana (streptomicina) - actividad metabólica alternativa (sulfonamida) virulencia (invasión, producción de toxina) simbiosis degradación de sustratos Por ser de interés en BM, ¿no deberíamos ver grupos de compatibilidad de plásmidos?

Temperados: forman profagos en las células infectadas (lisogenia) Virus Bacteriófagos Virulentos: lisan las células infectadas Temperados: forman profagos en las células infectadas (lisogenia) Conversión lisogénica: coevolución bacteria-fago

Genómica comparativa Análisis y comparación de genomas de diferentes especies Objetivos Entender cómo han evolucionado las especies Determinar la organización y función de los genes, los sistemas de regulación y las áreas no codificantes de los genomas

Herramientas Bases de datos públicas Software de análisis NCBI: National Center for Biotechnology Information Genomas, Genes, Proteínas, SNPs, ESTs, Taxonomía, etc 2005: 240 (B+A) genomas se encuentran en las bases de datos 2006: 340 (313+27) 2008: 678 (626, 52) TIGR: The Institute for Genomic Research Software de análisis Búsqueda de secuencias similares en las bases de datos, algoritmos de alineamiento: Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), agrupamiento de familias (clustering), predicción de genes, diseño de primers, etc.

Incluir la secuencia en una base de datos internacional BIOINFORMÁTICA Incluir la secuencia en una base de datos internacional Identifica las regiones codificantes y secuencias consenso Compara secuencias por homología AACGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGA GCGCACCTTTTAGAGTGAGCGGCAAACGGGTGAGTAAC GCGTGGGAATCTACCCATCTCTACGGAATAACACAGAG AAATTTGTGCTAATACCGTATACGTCCTATTTGGAGAA AGATTTATCGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGC TAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCA TAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTG AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGG AATATTGGACAATGGGNGCAACCCTGATCCAGCCATGC CGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTT TCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGC CCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAA GGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCG CATGTAGGCGGATATTTAAGTCAGAGGTGAAATCCCAG GNCTCAACCCTGGAACTGCCTTTGATACTGGGTATCTT GAGTGTGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGG TAAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAA GGCGGCTCACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAA AGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTC CACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGCGGTTT ACTGCTCGGTGGCGCAGCTAACGCGTTAAACATTCCGC CTGGGGAGTACGGSSGCAAGATTAAAACTCAAAGGAAT TGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA ATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACA TCCCGATCGCGGAAGGTGGAGACACCCTCCTTCAGTTA GGCTGGATCGGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAG CTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG CGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTTGGTTGGGC ACTCTAGGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGG TGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTG GGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAG CGAAGTCGCGAGGTCGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCT CAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGT CGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTG AATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACAC CATGGGAGTTGGTTTTACCCGAAGGTGCTG AGGATGAGCCAGATAGGA---ACCGATTACCGGATAGC ||||||| ||||||||| ||||||||||||||||| AGGATGA-CCAGATAGGAGTGACCGATTACCGGATAGC

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgi     240 Complete Microbial Genomes selected: [A] - 22, [B] - 218  save  ??? Question ??? What can we learn from a completely sequenced genome that we might not be able to establish with incomplete genome sequence?

?????? ¿Qué aprendemos de la secuencia completa de un genoma que no podemos establecer con una secuencia incompleta? ??? Question ??? What can we learn from a completely sequenced genome that we might not be able to establish with incomplete genome sequence?

Cromosoma de E. coli 100 minutos o 4.639.221 pb 88% 4288 ORF + 1% tRNA, rRNAs + 0.5% secuencias repetidas no codificantes + 10% secuencias regulatorias

Proteínas compartidas por tres E. coli GENOMA BACTERIANO Proteínas compartidas por tres E. coli CFT073 uropatogénica (5.016 prot.) MG1655 no patógena (4.288 prot.) O157:H7 EDL933 enterohemorrágica (5.063 prot.) 2996 (39,2%) 193 (2,5%) 1623 (21,2%) 585 (7,6%) 1346 (17,6%) 204 (2,6%) 514 (6,7%)

Dos grandes categorías de información genética en la célula procariota Información básica Varía poco y fundamentalmente por mutaciones puntuales Cromosoma básico Información flexible Varía mucho y fundamentalmente por herencia horizontal y recombinación Islas genómicas Bacteriófagos Plásmidos Transposones, etc. Vías metabólicas clave Envolturas celulares Ribosomas Metabolismo secundario Simbiosis Resistencia a antibióticos Transposición Patogenicidad

FACTORES DE ADAPTACIÓN encontrados en bacterias patógenas Proteasa IgA, ´coagulación, N-detoxificación OFENSIVOS Toxinas, invasinas DEFENSIVOS/ PROTECCIÓN LPS NO ESPECÍFICOS/ DE SOBREVIVENCIA Sideróforos, sistemas de transporte de nutrientes Microbiol and.Mol. Biol. Review, 2004, 68:560-602

Distintos tipo de islas genómicas Confieren al organismo una mayor adecuación a determinadas condiciones de vida. Vida libre en el medioambiente Islas ecológicas Vida en un hospedero como saprófito Islas saprofíticas Vida en un hospedero como simbionte Islas simbióticas Vida en un hospedero como patógeno Islas de patogenicidad (PAI) Las islas de patogenicidad codifican para factores de virulencia ADHESINAS SISTEMAS DE SECRECIÓN INVASINAS TOXINAS CÁPSULAS SISTEMAS DE CAPTACIÓN DE HIERRO

Evolución de las islas de patogenicidad Genoma básico tRNA 1-Integración de fago o plásmido 2- Mutación en gen int * 3- Mutación en gen mob 4- Deleción de genes inactivados 5- Integración al genoma básico con adaptación de codones tiempo progreso evolutivo LEE (EPEC), SPI-1 (Salmonella) PAI (UPEC) HPI (Y. enterocolitica) VPI (V. cholerae) HPI (Y. pestis)

Genómica comparativa Species bp ‘genes’ Haemophilus influenzae 1,830,137 1,743 Campylobacter jejuni 1,641,481 1,708 Mycobacterium tuberculosis 4,115,291 3,924 Neisseria meningitidis 2,184,406 2,121 Escherichia coli 4,639,221 4,288 Funciones: 20% metabolismo, 10% transporte, 10% regulación y replicación, 5% estructural, 5% síntesis proteínas, 50% desconocidos!

Aplicación de la genómica procariota:Genómica comparativa Fraser et al. Emerg Infect Dis. 2000 Sep-Oct;6(5):505-12. Comparación del número de secuencias codificantes predichas asignadas a categorías de roles biológicos en 7 especies de bacterias y archaes

Otra aplicación de genómica comparativa: Filogenética ?????? ¿Cuáles serían los genes más conservados entre procariotas y eucariotas? ¿Qué genes son variables y cuáles han sido perdidos?

Comparación de Genomas de cepas patógenas:

Genómica Genómica estructural: caracterización y localización de las secuencias de los genes en el ADN (organización) Genómica funcional: - EST (Expressed Sequence Tag) una secuencia parcial de un cDNA clonado - Microchips o microarrays de genomas completos - Genética reversa

Micromatrices (microarrays) Genoma total de levadura Animación: http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/chip.html

Genetics clásica versus genética reversa creación de mutaciones en la cepa gen secuenciado aislado   Selección de mutantes Mutación del gen Análisis de mutantes selección del mutante función a través del fenotipo correlación de la mutación con el fenotipo

Las metodologías de Genética reversa son parte importante de la genómica funcional Uno de los métodos tradicionales de GR ha sido el uso de transposones para el "knock out“ de un gen específico Para superar las limitaciones de este se desarrolló el proceso: Targeting Induced Local Lesions In Genomes, o TILLING: inducción de muchas mutaciones puntuales analizadas rápida y automáticamente

Dogma central de la Biología Molecular

PROTEÓMICA: Estudio de la estructura y función de todas las proteínas de un genoma: Establecer la función de las proteínas Conocer las interacciones proteína-proteína Correlacionar la función de las proteínas con las interacciones y su integración en el funcionamiento total de la célula

Genoma --->Transcriptoma---> Proteoma                                                                                                                                          Contexto-independiente: el material celular fijo por célula u organismo. Contexto-dependiente: material celular que varía entre diferentes tipos de células, condiciones ambientes, etc.  

Análisis proteómico Separación de proteínas:Electroforesis en geles de 2D ( size,  charge). Identificación de proteínas. Cuantificación de proteínas. Análisis de secuencias de proteínas. Proteómica estructural: rayos-x, cristalografía y espectroscopía NMR. Proteómica de interacciones. Modificación de proteínas.

Comparación de Proteomas por la diferencia en la expresión de las proteínas

Diferentes caminos para identificar los productos de un gen La caracterización de genes requiere una combinación de técnicas genómicas y proteómicas