Biología molecular Talasemias

Estructura molecular de los genes a-globina duplicados Regiones homologas: X- Y (4,2)-Z (3,7)

Entrecruzamiento hacia la derecha Entrecruzamiento hacia la izquierda

b-talasemia Clasificación Relación Fenotipo/ Mutación: Beta +: La mutación no impide que el gen sintetice algo de globinas beta. Beta 0: La mutación impide totalmente la síntesis de globinas beta, bien porque no se produce RNAm o bien porque se produzca pero no sea traducible. 

Los genes de las globinas: Consiste de estructuras exon e intrones. Se refieren al ADN codificante y no codificante, respectivamente, del gen. INTRONES Inicia con un sitio dador consenso (G100U100A62A68G84U63..) Tiene un punto de ramificación cercano al sitio 3’ del intron (no es un sitio consenso muy conservado UACUAAC) Finaliza con un sitio aceptor consenso (12Py..NC65A100G100) UG AG UACUAAC

5’ 3’ NUCLEO CITOPLASMA Transcripción Capping y Poliadenilación GT AG TGA -200-500 FT Caja GC -90 Caja CAAT -75 -30 TATA 5’ 3’ Enhancer 5’ UTR +1 3’ UTR FTII RNA pol II + Transcripción UGA Señal de clivaje y poliadenilación20-30nt 5’ UTR GU AG GU AG 3’ UTR AAUAAA RNA Transcripto Primario Capping y Poliadenilación NUCLEO UGA CAP 5’ UTR GU AG GU AG 3’ UTR AAAAAAAAA 7-metilguanosina Splicing RNA nuclear pequeño (snRNA) Spliceosoma UGA GU GU CAP 5’ UTR AG AG 3’ UTR AAAAAAAAA UACUAAC GU Lazo o LARIAT AG RNA mensajero MADURO CAP 5’ UTR 3’ UTR AAAAAAAAA CITOPLASMA

RESUMEN: Tipos de Mutaciones Fenotipo MUTACIONES TRANSCRIPCIONALES: Elementos regulatorios del Promotor 5’UTR + o ++ ++ o + MUT. PROCESAMIENTO RNA Unión splice IVS cd 1, 2 ó 3 Sitios dadores (fuera del cd 1-3) o puntos de ramificación Señal polyA Region 3’UTR 0 + o ++ MUT. TRADUCCION RNA Codon AUG Codon stop (ej: Cd 39 exón 2) Cambio marco lectura

PCR+ ER

87,5%

TECNICAS UTILIZADAS PARA EL DIAGNOSTICO MOLECULAR DE LAS TALASEMIAS. (REPASAR TEMA 1)

Alfa Talasemias MUTACIONES

 +



a- Talasemias: Southern Blot y análisis de la secuencia de ADN Gap-PCR Otro método es el MLPA (Amplificación de Sondas dependiente de Ligamiento Múltiple

TECNICA DE SOUTHERN: HIBRIDACIÓN 1. NaOH 1N 2. Tris buffer 3. 20xSSC (NaCl 3M, Citrato Na 0.3M)

PCR Multiplex Es una variante de PCR en donde dos o más loci son simultáneamente amplificados en la misma reacción.

PCR Multiplex Cuidados especiales: 1-Los primers de 18-24 pb deben tener un contenido de GC 35-60% de esa forma tiene una T anneling de 55-58ºC o mayor. 2-Distribuir los amplicones de distintos tamaños. 3-Diseñar primers con características similares: sin estructura secundaria ni interacciones entre ellos. 4-Se debe calcular el Tm (no muy diferentes entre primers) y analizar las interacciones primer-primer).

Variante de una PCR-multiplex Gap- PCR Variante de una PCR-multiplex

Se utiliza gap-PCR para diagnóstico de:

GAP-PCR Una gran deleción reune a los primers AC y se produce la amplificación Usada en la identificación de deleciones en el gen de - globina. A B C Normal: A and B da un producto; A y C están demasiados apartados no hay producto PCR Deleción: A y C ahora dan un producto, el cual es diferente en tamaño al producto A y B.

a- Talasemias: Amplificación de Sondas dependiente de Ligamiento Múltiple (MLPA)

Instrumentos Un termociclador y un sistema de electroforesis tipo de secuencia son requeridos para MLPA Los resultados son obtenidos en 24 hs. Mas de 96 Ms pueden ser procesados en un experimento

Mix-Probes MLPA probes consiste de 2 oligonucleotidos: La sonda oligonucleotido izquierda(LPO) (7) y la sonda oligonucleotido derecha(RPO) (8)

Protocolo típico de MLPA

Cluster α- globina y localizaciones de las probes de MLPA. Las deleciones Heterocigotas: gris Las deleciones Homocigotas: en puntos. Las Duplicaciones. Barras negras. Los extremos punteados se localizan las regiones breakpoints Los Asteriscos (*) indicate the real-time PCR primers used in this study. # indicate nº de muestras analizadas.

MLPA histograms showing dosage effects in samples #15 (α-thal trait carrier), 21, 23 (HbH patients), and 25 (thalassemia intermedia patient).

Bibliografía general: LEHNINGER ALBERT L., COX MICHAEL M., NELSON DAVID L. “Principios de Bioquímica”. Editorial OMEGA 4º Edición. 2006. Diapositivas en Power Point (formato ppt) (Manual para docentes) LEHNINGER ALBERT L., COX MICHAEL M., NELSON DAVID L. “Principios de Bioquímica” Web: http://bcs.whfreeman.com/lehninger/ The Journal of Biological Chemistry: Classic Articles Web: www.jbc.org VOET DONALD, VOET JUDITH G. “Bioquímica” Editorial MÉDICA PANAMERICANA. 3º Edición, en Español. 2006 WATSON, BAKER, BELL, GANN, LEVINE, LOSICK “Biología Molecular del Gen” Editorial MÉDICA PANAMERICANA. 5º Edición, en Español. 2006 STRYER LUBERT, BERG JEREMY M., TYMOCZKO JOHN L. ”Bioquímica” Editorial REVERTE. Edición 5º Edición, en Español. 2003 MATHEWS CHRISTOPHER K., AHERN KEVIN G., VAN HOLDE K. E. ”Bioquímica” Editorial PEARSON EDUCACION. 3º Edición en Español. 2003 Diapositivas (formato ppt), Problemas (Manual para docentes) y Casos Clínicos de Aplicación VOET DONALD, VOET JUDITH G. and PRATT CHARLOTTE W. “Fundamentals of Biochemistry” Second Edition. Copyright © 2006 by John Wiley & Sons, Inc Web: www. medicapanamericana.com/voet/

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Bibliografía especifica: Charles R. Scriver, Arthur L. Beaudet, William S. Sly and David Valle: THE METABOLIC AND MOLECULAR BASES OF INHERITED DISEASE. Volume I,II and III. Seventh Edition.Mc Graw-Hill Editors Trabajos publicados en revistas de la especialidad. BLOG: http://qbpatologica.wordpress.com/