Estructura de Genes, Transcripción y Procesamiento del ARNhn

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1 Estructura de Genes, Transcripción y Procesamiento del ARNhn
Biología Molecular: Replicación del ADN Estructura de Genes, Transcripción y Procesamiento del ARNhn Pedro A. Moreno Escuela de Ingeniería de Sistemas y Computación Facultad de Ingenierías Universidad del Valle Cali, COLOMBIA

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3 Ciclo Celular en Eucariótes

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5 Flujo de la Información Genética Intracelular

6 Flujo de la Información Genética Intracelular
de los Genes Interrumpidos

7 Maquinarias Moleculares Asociadas

8 Experimento de Meselson y Stahl

9 Experimento de Meselson y Stahl

10 Sobrevisión de la Replicación

11 Características Generales de la Replicación
Orígen de replicación Bidireccional 3. Hebra continua Hebra discontinua 4. Semiconservativa 5. Dirección 5’ ’ 6. DNA polimerasa I / II / II : procariotas 7. DNA polimerasa  /  / : eucariotas 8. Una batería de moléculas accesorias 9. Fases: Iniciación, Elongación, Terminación En esta se observa un ADN eucariótico en el cual vemos los Telómeros (Tel) y se demarcan los sitios Term (T) y Ori (O). Este fragmento de ADN en el cual se encuentran los sitios T - O - T es lo que ha sido llamado Replicón. Replisoma: Se le llama al “cuerpo” o segmento de ADN que se replica junto a sus proteínas que permiten este proceso. La replicación, tiene varias características especiales, que son: 1) Es bidireccional: Esto significa que se da tanto en la hebra 5’ como en la hebra 3’ . 2) Se da dejando una cadena o hebra continua y otra discontinua (ver explicación en el mecanismo de la replicación, Diapositiva No 34 y 35 3) Es semiconservativa: Esto significa una doble hélice de ADN, “nueva” o “replicada”, queda finalmente conformada por una cadena original que es como una “plantilla”, mientras que la otra es la cadena recien sintetizada o replicada. 4) La replicación se da en orientación 5’ >3’ 5. En Procariotes, participan tres tipos de ADN polimerasas: I, II y III En Eucariotes, participan tres tipos de ADN polimerasas: ,ß y  6. La replicación se da mediante una batería de moléculas accesorias. 7. La replicación se da en 3 Fases básicamente: a. Iniciación b. Elongación c. Terminación

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13 Sitio de Iniciación en Eucariótes
Sitio de Iniciación en Virus y Bacterias 1) Ori (Origen de replicación): O 2) Term (Sitio de terminación): T Ori Ori Virus y Bacterias Ter REPLICACION DEL ADN. Una vez se comprobó que el ADN era el material hereditario y se descifró su estructura, lo que quedaba era determinar cómo el ADN copiaba su información y cómo la misma se expresaba en el fenotipo. Mathew Meselson y Franklin W. Stahl diseñaron el experimento para determinar el método de la replicación del ADN, cuyos pasos se recrean de la siguiente manera : El ADN tiene dos sitios característicos en la replicación: 1) Ori (Llamado así, porque se asocia con el sitio de origen de la replicación) 2) Term (Llamado así, porque se asocia con el sitio de terminación de la replicación) Estos sitios han sido muy bien estudiados en modelos de virus y bacterias. Sitio de Iniciación en Eucariótes Telómero Telómero T O T O T O T O T Eucariotas Replicón R R

14 Sitio de Iniciación en Eucariótes

15 Iniciación de la Replicación del ADN Bacteriano
DNA B + C 1) Dna A (Relaja) B Helicasa (abre ) C SSB La replicación del ADN, que ocurre cada una sola vez en cada generación celular, necesita de muchos “ladrillos”, enzimas, una gran cantidad de energía en forma de ATP. La replicación del ADN en el ser humano se realiza a una velocidad de 5o nucleótidos por segundo, en procariotas se da a 500/segundo. Los nucleótidos tienen que ser armados y estar disponibles en el núcleo conjuntamente con la energía para unirlos. La iniciación: Esta acontece siempre en un cierto grupo de nucleótidos, el origen de la replicación, requiere entre otras las enzimas: Dna A : Que relaja la tensión entre las cadenas. Dna B y C: Con actividad de helicasas abren las dos cadenas. En este paso, se inicia lo que se ha llamado por su forma, burbuja u ojal de replicación. SSB (Por sus siglas en inglés: single strand binding) o proteinas de unión cadena simple: Estas evitan que las dos cadenas se vuelvan a reasociar, es decir mantienen a las dos cadenas en forma de cadena simple. J K SSB SSB B + C SSB: Proteínas de unión a cadena sencilla (Single strand binding) SSB

16 Elongación de la Replicación del ADN Bacteriano
J K Primasa Dna G (ARN pol) 5’ 3’ B+C 3’ 5’ 3’ 5’ Ojal de Replicación 2. Elongación (Continuación de la Iniciación) J y K: Enzimas que se unen a las B y C para colaborar en la actividad de helicasa y el mantenimiento del ojal de replicación. “Primer” o Cebador: Esta enzima que también ha sido llamada Primasa (Dna G) o ARN-polimerasa ADN dirigida. Esta enzima muy particular, se une a la cadena de ADN que se encuentra en forma de una sola hebra para sintetizar un pequeño fragmento de ARN en orientación 5’ a 3’ que hace complementariedad con la cadena de ADN, dejando establecido con esto el inicio de la reacción de replicación. La elongación: Aquí se mantienen las dos hebras separadas por las SSB, y se observan los dos fragmentos de ARN sintetizados en orientación 5’ a 3’ en las dos cadenas. Para iniciarse la elongación, la que se da a una gran velocidad, se necesitan dos nuevas enzimas que se suman a las iniciales llamadas, la Girasa que hace que la cadena se desentorche a mucha velocidad, y la Topoisomerasa I que realiza los cortes en la cadena que está en la orientación 3’ a 5’, para liberar la tensión en esta cadena formando con estos cortes, los llamados Fragmentos de Okasaki. Se observan las flechas que definen la dirección de la ADN Polimerasa III que será la que irá sintetizando los nuevos nucleótidos de acuerdo a la plantilla de la cadena. 5’ 3’ GIRASA 5’ 3’ 5’ Topoisomerasa I 5’ 3’ Girasa GIRASA 3’ 5’

17 (Primasa) o ARN - pol DNA Dirigido o Iniciador (Primer)
Elongación de la Hebra Continua DNA pol III Dna G Girasa (Primasa) o ARN - pol DNA Dirigido o Iniciador (Primer) + Topoisomerasa I Replisoma 3’ 5’ 3’ En el recuadro se observa la reacción general de la elongación, conformando lo que ha sido llamado como el replisoma: Plantilla de ADN + ADN Pol III + Dna G (Primasa) o ARN polimerasa ADN dirigida + Girasa + Topoisomerasa = Replisoma En esta diapositiva, también se observa el crecimiento de la cadena que va en sentido 5’ a 3’ mientras la ADN pol la va recorriendo. Pero, cómo se logra que se sintetice al mismo tiempo la cadena que está en sentido contrario al sentido 5’ a 3’ que reconoce la enzima ADN Pol III? Veámoslo en la siguiente diapositiva. 3’ 5’ 5’

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20 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ Hebra continua DNA POL - III
SSB 3’ DNA POL - III 5’ 3’ 5’ RNA 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ En esta diapositiva se observan las dos cadenas que van sintetizándose de manera simultánea, dejando a su vez a una cadena que se sintetiza de forma de hebra continua y otra de hebra discontinua. En esta última, los cebadores se pegan a los Fragmentos de Okasaki dejados por la Topoisomerasa I iniciando una replicación de fragmentos de ADN de 1000 a 2000 pb. Veamos ahora como se logra que la enzima “reconozca” a ambas cadenas y realice la síntesis de las dos cadenas simultáneamente? Para que esto suceda se da un evento muy curioso; la cadena que está en sentido 3’ a 5’ cambia momentáneamente la orientación haciendo un “giro” en la cadena para quedar también en sentido 5’ a 3’ y poder ser reconocida por la ADN Pol III. pb pb Hebra discontinua

21 DNA Pol III RNA (Nick translation) Corta y cambia:RNA por DNA
En esta se observa la replicación de las dos cadenas, pero recordemos que en la cadena 3’ a 5’ estamos dejando una cadena con un ácido nucleico híbrido compuesto por el ADN recién sintetizado y el ARN del cebador o “primer” . Debido a lo anterior, y para obtener una cadena compuesta solo se ADN, ocurre un mecanismo denominado Corte y Cambio de ARN por ADN el cual es realizado por ADN Polimerasa I.

22 Terminación de la Replicación del ADN Bacteriano
DNA LIGASA Dependiente de ATP La Terminación: Este paso se realiza mediante la acción de la ADN Ligasa dependiente de ATP, que sella y afirma los nuevos fragmentos de ADN recién sintetizados por la ADN Polimerasa I, que reemplazaron a los fragmentos de ARN. La Replicación tiene una reacción general: 1 molécula de ADN + deoxinucleótidos n en presencia de ADN pol III, ADN pol I, y moléculas accesorias, producen 2 moléculas de ADN + 2 pirofosfatos n.

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28 Estructura del Gen Procariote
Un gen Procariote yace en una región que se llama la UT (Unidad de Transcripción. La que se transcribe) Tiene 2 regiones Región codificante: Donde se codifica el gen Región Promotora: sitio a partir del cual se transcribe y se regula el gen El Sitio SIT +1, el sitio a partir del cual nace el Transcrito primario o ARN. SIT: +1 Sitio de Inicio de la Transcripción. Punto limitante entre la región codificante y la región promotora (Start point = sp)

29 Estructura del Gen Procariote
3’ 5’ 5’ 3’ Convenciones: UT: Unidad de transcripción SIT: Sitio de iniciación de la transcripción UTR: Región no traducida ( 5´o 3´) CI: Codón de iniciación CT: Codon de terminación STT: Sitio de terminación de TTS: Transcription termina- tion site. UT Región Promotora ( RP ) Región Terminadora ( RT ) Región Codificante ( RC ) Estructura del gen Procariote. Un gen Procariote yace en una Unidad de Transcripción (UT), constituida por tres regiones principales: 1) Una región promotora (Sitio a partir del cual se regula la expresión del gen. 2) Una región codificante que define la naturaleza codificante del gen. 3) Una región de terminación que controla la terminación de la transcripción del gen. 5’ UTR 3’ UTR 3’ 5’ Región no traducida 5’ 3’ +1 CI (ATG) CT STT  TTS SIT

30 Estructura del Promotor Procarióte
Región O (operadora): Se pega al 7-8 nucleot. Represor (Impide que se abra el ADN, se una la RNA pol y por ende, que se Transcriba el gen) 3’ 5’ +1 SP Control positivo + 1SP: “Punto de arranque” También se llama sitio SIT (Sitio de Inicio de la Transcripción): Sitio en el cual entra el primer nucleotido en el RNAm. Caja Pribnow CajaCRP CajaCAT Control negativo Estructura del Promotor Procariote. La Región Promotora es el sitio en el cual se regula la expresión del gen, mediante inducción o represión que se ejerce sobre la región operadora (O) del gen, mediante Control Negativo. El Control Positivo se ejerce sobre la Caja CRS. Se observan tres tipos de cajas: la Caja CRS, la Caja Pribnow (-10) y la Caja CATA (-35),y una región operadora, las cuales son reconocidas por la RNA-Polimerasa bacteriana. Región O Se abre el ojal de transcripción para la transcripción del gen. -65 -35 -10 -2 -1 + 1 Proteína Represora del Catabolito Secuencia Represora del Catabolito Caja Pribnow: tetranucleotido rico en AT. CRP CRS

31 Estructura de la Región 5´UTR
+1 CI (AUG) pb 5’ UTR ’UTR “Se transcribe pero no se traduce” CI * * * Espacios conectores 10 pb +1 RBS ARNr + proteína Estructura de la Región UTR (Del inglés Untranslated Region). Región no traducida por los ribosomas, se transcribe pero no se traduce a proteína. La secuencia S/D (Shine/Dalgarne) es rica en polipurinas y su extremo 5’ en forma de ARNm es complementaria al extremo 3’ del ARNr 16S de la subunidad menor del ribosoma. Sitio de Unión al Ribosoma Ribosoma Poly - Purinas A - G S/D RBS: (Del inglés Ribosomal Binding Protein) Secuencia Shine/Dalgarne Se une al 3’ARNr 16s (subunidad menor)

32 Estructura de un Policistrón (OPERON)
Promotor CI CT Tres Genes 1 2 3 CI CT CI CT CI CT RNAm Estructura de un Policistrón (Operón). Se encuentra en los Procariotes en la región comprendida en entre el codón de iniciación (CI) y el codón de terminación (CT) y bajo el control de una misma región promotora. Esta estructura de la región codificante en tandem es llamada Policistrón u Operón debido a que los genes se transcriben juntos bajo el control de una misma región promotora y sus productos se encuentran relacionados metabolicamente, como por ejemplo, el operón lactosa (Lac). Nótese que entre los genes queda una región intergénica corta. Cada cistrón o gen es traducido en tandem por el mismo tipo de ribosoma, previa liberación del polipéptido anterior. 5’ 3’ Región Intercistrónica larga: diferentes ribosomas traducen ARNm 5’ 3’ > 1 gen: - Policistrónico - Un operón Región intergénica corta E. Coli: tiende a tener promotores con 3 genes en promedio

33 Estructura de la Región Terminal
STT 5’ 3’ UTR 3’ SDR: Señal de degradación del RNA m = Ribonucleasa o RNasa Se descompone en sus partes Estructura de la región terminal en genes procariotes. Esta se encuentra entre el codón de terminación (CT) y la Señal de terminación de la Transcripción (STT). Estas estructuras son de dos tipos: independientes de ρ o dependientes de rho. Las primeras son terminales intrínsecos que no dependen de la subunidad ρ (una proteína hexamérica) para ser reconocidas por la ARN pol y terminar la transcripción. Por el contrario, las STT- ρ dependientes requieren del factor ρ para que la ARN pol puede reconocerlas las asas ρ dependientes, en el contexto del ARNm, y terminar la transcripción. Factor de terminación de la transcripción: STT:  dependiente GC:  independiente Terminales intrínsecos STT:  independiente GC:  dependiente Fígura hexaménica de proteínas

34 Estructura del gen Eucariote: Tres Tipos de Genes
Existen 3 clases de genes transcritos por 3 ARN pol diferentes: ARN pol I, II y II Genes ARN pol I: Nucleolo ARNr Clase I ARN pol II Nucleoplasma ARNm ClaseII ARN pol III Nucleoplasma ARNr 5S (excepción)Clase III Estructura del gen eucariote: Tres tipos de genes. A diferencia de los procariotes, en los eucariotes existen tres tipos de ARNpols: ARNpol I, ARNpol II y ARN pol III. Cada una esta especializada en transcribir tres clases de genes diferentes, con algunas excepciones. ARNnp ARNt

35 Estructura del Gen Eucarióte: Clase I
UT RT RP RC +1 CI CT IRE ARE 5’ 3’ 5’ UTR 3’ UTR 3’ DFR DCR DCE 5’ UFR UCR UCE SP CI +1 AAUAAA Estructura del gen eucariote – Clase II Una UT clase II que muestra las regiones UTRs 5’ y 3’ principalmente. Posteriormente se verán en detalle las partes de la estructura de este gen. SI + 10 cap Secuencia Líder: Proteínas que atraviesan la membrana y aa hidrofóbico IRE ARE 7 metil guanosina Elemento rico en hierro 50 pb Rico en AU Elemento rico en AU Depende del hierro Paradegradadar el RNAm Asa 5’ Secuencia consenso Desestabiliza el poly A

36 Estructura Básica del Promotor - Clase II
5’ 3’ 3’ 5’ RP = Región Promotora +1 sp RR = Región Reguladora Caja TATA -65 -35 Hexapleta rica en AT Elementos de respuesta Caja CAAT Caja TATA Caja GC Se regulan lo genes caseros (“House Keeping genes”) Estructura del promotor Clase II. Promotor eucariote prototípico mostrando las cajas TATA, CAAT y elementos de respuestas curso arriba. Otros tipos de promotores son hechos exclusivamente de elementos GC o combinaciones de estos con cajas TATA y CAAT. Existen: - Elementos de respuesta a estrógenos, corticoides, glucocorticoide - Dependientes del tejido Se pegan factores inducibles a esta región promotora o fuera de ella. Puede haber otras cajas dependiendo del tipo de gen y también los genes especializados como los morfogenes o como los genes homeóticos (desarrollo) o de diferenciación

37 Estructura de la Región Codificante - Clase II
Exón n Exón n+1 Intrón 3’BA’ 5’BD’ BD: brazo dador BA: brazo aceptor Empalmar Exones AG GT GU AG GU AG GU AG SR: Sitio de ramificación (Branch site) Regla GU - AG: Secuencia Consenso: al inicio y al fin del intrón Estructura de la región codificante Clase II. Los genes interrumpidos son genes constituidos por una serie alterna de exones e intrones. En eucariotes existen genes con un intron o hasta con más de 100 intrones. En promedio un gen interrumpido humano tiene de 5 a 7 intrones. Los intrones son generalmente más grandes (500pb de longitud) que los exones ( pb). El límite exón-intrón esta dado por la presencia de bases consenso GU----…----AG localizadas en los extremos 5’ y 3’ respectivamente de los intrones. Los exones son los que llevan la información codificante para proteína y los intrones no. Una vez es transcrita la región codificante a ARNhn, los intrones son removidos por el “esplaiceosoma” (una serie de ribonucleoproteínas U, RNP-Us: U1, U2, U4, U5 y U6) y los exones empalmados y transportados en forma de ARNm al citoplasma SITIO DE RAMIFICACION T A C T A A C Se localiza a 2/3 longitud del intron X: 5 intrones (mamíferos) Siempre presente BS: - Consenso - Rica en pirimidina (T y C) X: 2 intrones (Otros organismos)

38 Amplificadores y Silenciadores (ENHANCERS – SILENCERS)
RP SP +1 Amplificador * Amplificador Silenciador Amplificadores y silenciadores. Son secuencias consenso que intensifican o decrecen la tasa de transcripción de los genes. Estos se localizan generalmente miles de pares de bases curso arriba de un promotor o curso abajo del mismo. En ocasiones pueden estar localizados dentro de un intrón. Regulación temporal y tejido especifica en los Genes Clase I y Clase II Silencian a los enhancers o amplificadores de expresión Ejemplo: *: Hígado : Glucogenasa Amplificador: Secuencia consenso - Región amplificadora del gen - Ubicua: Puede estar hasta dentro de los intrones excepto en los exones

39 Estructura del Gen Eucarióte - Clase I
Core del promotor -110 -40 -10 SP +1 28 S 5.8 S 18 S -170 GC Se transcriben en tandem -70 pb Región espaciadora entre core promotor y la región UCE (elementos de codificación no traducidos) Ribonucleasas Estructura del gen eucariote Clase I. Los genes clase I generalmente se encuentran en tandem de 1000 a 3000 copias, debido a la necesidad activa de reciclar los ribosomas de la célula eucariota. En procariotas están organizados los genes para ribosomas de igual manera que los eucariotas con la excepción de que hay 1000 y 2000 copias en tandem del mismo gen

40 Estructura del Gen Eucariote - Clase III
SP +1 5’ 3’ 3’ 5’ Octámero ARNtala ARNtmet PSE TATA RP RC UT Estructura del gen eucariote Clase III. Estos genes también se encuentran en tandem en un gran número de copias. La característica más conspícua que los diferencia de los genes clase I y II es que los genes clase III llevan promotores internos dentro de la región codificante (cajas B y C) que da origen al ARNt y cuya función es atraer la ARN pol III, la cual una vez unida a estos, se desplaza hacia la caja TATA, esta sí curso arriba de la región codificante, para iniciar la transcripción. Box A Box C Se une la RNA pol III 90 pb 

41 Procesamiento del Gen Eucariote - Clase III
ARNt ala ARNr 5S ARNt met Procesamiento del gen Clase III. Una vez transcrito el ARNhn clase I es procesado por ribonucleasas para liberar los ARNt y el ARNr 5S. Ribonucleasa

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45 La ARN Polimerasa Bacteriana

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49 Descubrimiento de los Genes Interrumpidos

50 Estructura de un Gen Interrumpido
Eucariótico Clase II

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53 Complejo de Iniciación
Formación del Complejo de Iniciación de la Transcripción de los Genes Clase II

54 ARN Polimerasa II de Levadura

55 Activadores Interactuando con el Complejo
de Iniciación en los Genes Clase II

56 Complejo de Iniciación
de la Transcripción en los Genes Clase I

57 Complejo de Iniciación
de la Transcripción en los Genes Clase III

58 Complejo de Terminación
de la Transcripción en los Genes Clase II

59 Procesamiento del pre-ARNm Clase II

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61 Secuencias Concenso de un Intrón
Típico Clase II

62 Tipos de Procesamientos de pre-ARN

63 Reacciones en el Esplaiceosoma de los pre-ARNm Clase II

64 Maquinaría Molecular del Esplaiceosoma y Procesamiento del pre-ARNm

65 Uniones Específicas de las RNPs

66 El Transcripsoma

67 Post-transcripcional
Mecanismos de Control Post-transcripcional

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69 BIBLIOGRAFIA Lodish, H; Baltimore, D; Zipursky, L.; Matsudara, P.; Darrell, J. Molecular Cell Biology. Third Edition. Scientific American Books New York, 1997. Lewin, Benjamin. Genes VII. International Student Edition. Oxford University. Press, Inc. Nex York, 1999