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Control de la genuinidad de componentes mayoritarios en los vinos por técnica HPLC-IRMS Lic. Yésica R. Baldo Ing. Ariel O. Borgioli Normas Analíticas Especiales Subg. de Investigación para la Fiscalización Laboratorio General Subg. Normalización y Fiscalización Analítica

¿Qué es un alimento genuino ¿Qué es un alimento genuino? Según el Código Alimentario Argentino (CAA) es aquel alimento que no contiene sustancias no autorizadas ni agregados que configuren una adulteración, siempre y cuando el mismo sea expendido bajo la denominación y rótulo legal.

¿Qué es un vino genuino? Definición legal INV: Producto obtenido por la fermentación alcohólica de la uva fresca y madura o del mosto de la uva fresca, elaborados dentro de la misma zona de producción…En consecuencia, ningún otro líquido, cualquiera sea su origen o composición, podrá designarse con el nombre de vino, precedido o seguido de cualquier adjetivo (salvo excepciones).

¿Qué es un alimento adulterado ¿Qué es un alimento adulterado? Definición legal del CAA: Se le extrajo en forma parcial o total sus elementos útiles o característicos, reemplazándolos o no por otros inertes o extraños, o ha sido adicionado de aditivos no autorizados o sometido a tratamientos de cualquier naturaleza para disimular u ocultar alteraciones, deficiente calidad de materias primas o defectos de elaboración.

Artículo n° 23 Ley 14878 Productos NO GENUINOS: Aquellos cuya composición anormal no pueda ser justificada, incluyéndose dentro de los mismos los “ADULTERADOS” y “AGUADOS y/o MANIPULADOS”.

Artículo n° 23 Ley 14878 Productos NO GENUINOS: …Se considerará PRODUCTO AGUADO Y/O MANIPULADO aquel al que, en cualquier momento de su elaboración o depósito, se le haya adicionado agua u otras sustancias que, aún siendo normales en el producto, alteran su composición o desequilibran la relación normal de sus componentes.

El vino como objeto de análisis ¿Cuáles son sus componentes mayoritarios?

100% azúcares asimilables Fermentación de la uva 100% azúcares asimilables Alcohólica 92% etanol Glicero-Pirúvica 8% Glicerol

GLICEROL Su producción es muy estable durante la fermentación. Es sinónimo de calidad en los vinos. Por ello a veces Se producen ADICIONES FRAUDULENTAS

ADICIONES FRAUDULENTAS Tipos: Glicerol sintético Glicerol natural pero exógeno ¿Qué debemos hacer? Autenticar alimentos Detectar adulteraciones

OBJETIVO DNAE Establecer un procedimiento analítico de caracterización simultánea de la relación isotópica C13/C12 de Glicerol y Etanol en vinos, usando HPLC-IRMS. Este método isotópico permite la determinación C13/C12 de ambos analitos en la misma corrida, directamente de una muestra líquida sin aislamiento previo de glicerol o etanol, superando dificultades técnicas asociadas a tratamientos de muestra complejos, logrando simplicidad y velocidad.

¿Cómo podemos detectar estas adulteraciones?

Método IRMS “Medida del contenido de isótopo estable de elementos biológicamente importantes (H, C, O), de un producto o componente específico”.

¿Qué es un ISÓTOPO? “Cada una de las variedades de un átomo de cierto elemento químico en donde el núcleo presenta el mismo número atómico (Z), constituyendo por lo tanto el mismo elemento, pero presenta distinto número másico (A)”.

Áreas generales de Interés Biológico, farmacéutico, médico y ambiental. Ejemplos: Estudio metabólicos Autenticación farmacéutica Autenticación alimentaria Control “doping” Investigaciones biogeoquímicas

Aplicaciones del IRMS en el vino “Determinar y cuantificar los agregados de agua, azúcar de caña, alcohol no vínico y/o glicerol, basados en la estabilidad de los isótopos de C y O”.

Distintos metabolismos fotosintéticos de los vegetales: ¿En qué se fundamenta? Distintos metabolismos fotosintéticos de los vegetales: Ciclo de Calvin o C3 para vid y remolacha; y Ciclo de Hatch y Slack o C4 para caña de azúcar y maíz). Así se logran determinar distintos fraccionamientos isotópicos (mayor contenido en C13 para metabolismos con C4).

¿Por qué HPLC-IRMS? Permite fácil separación: Muchos componentes NO VOLÁTILES. De componentes individuales de una muestra en un solo paso. Características de los componentes: Alto PM Alta polaridad Inestabilidad térmica Baja Pº Vapor

HPLC- IRMS VENTAJAS: Poca preparación de muestra. Se requiere menos muestra que para EA (100 veces). No derivatización. Introducción directa de la muestra. Alta sensibilidad (incluyendo cantidades de muestra de hasta 50 ng en modo de inyección directa). Presenta sólo 2 variables (flujo del agente oxidante y flujo de He). DESVENTAJAS: Es más complicado que GC, ya que el CO2 ha sido generado y extraído de la fase líquida.

Esquema HPLC-IRMS

Oxidación Química en fase móvil acuosa Agente oxidante: Peroxodisulfato Na2S2O8 0,5 M en agua ultrapura. Reactivo Ácido/Catalizador: H3PO4 0,5 M y H2SO4 5.10-3 M en agua ultrapura. Patrón: Glicerol PA y Etanol PA Eluyente o fase móvil: agua ultrapura.

Baño de Ultrasonido Para desgasificación previa Se usa un vacío de agua Se purga con flujo constante de Helio para prevenir contaminación de CO2 del aire ambiental durante la operación. Se aplica tanto para fase móvil como para agentes oxidantes y reductores.

INTERFASE LC ISOLINK

Unidad de Separación de membrana INTERFASE LC ISOLINK Unidad de Separación de membrana Open Split Reactor de oxidación Separador de agua

UNIDAD DE SEPARACIÓN DE MEMBRANA (CO2) Consiste en membranas de excelente permeabilidad al CO2. Como un gas carrier, el He fluye a 1 ml/min purgando el exterior de la membrana, en contra del flujo principal. El material de la membrana es de patentamiento de Thermo. Para mejorar la eficiencia de separación hay 3 membranas.

UNIDAD DE SEPARACIÓN DE MEMBRANA (CO2) Las P° Parciales del H20 y el CO2 contribuyen a la P° Total y tienden a pasar la membrana. Debido al Δ [] y al Δ P, el CO2 será disuelto en el He libre y removido de la fase líquida por la corriente de He. La FM deja la membrana de intercambio como una solución desgasificada en el contenedor de desechos. Allí mismo son recolectados los líquidos de la bomba HPLC, agente oxidante y agente reductor.

UNIDAD DE SEPARACIÓN DE MEMBRANA (CO2) El capilar es insertado directamente en la membrana. Debido a que, en su diseño, es necesario un “ferrule” especial, no es posible cambiar membranas o capilares u otras partes en la unidad de separación. Si algo se rompe, la unidad entera debe cambiarse.

UNIDAD DE SEPARACIÓN DE MEMBRANA (CO2) ¿Cómo asegurar su vida útil? No exponer la membrana a flujos superiores al valor crítico (700 µl/min) en todo el sistema. 500 µl/min en el HPLC y 200 µl/min total para las 2 bombas del ISOLINK. Prevenir presencia de partículas en el sistema. Nunca desenroscar sus conectores metálicos.

SEPARADOR DE AGUA (GAS DRYER) El agua es removida de la corriente eluyente empleando una membrana tubular NAFION®. El volumen anular es purgado continuamente por una contracorriente de He seco (20 ml/min).

OPEN SPLIT El capilar se inserta en un ensamblado “open split” con capilar de muestreo retráctil al espectrómetro de masas. El “open split” está hecho de un tubo de vidrio con un conector que se ajusta a presión, pegada en un lado.

DETECTOR IRMS Fuente de ionización. Tubo de vuelo. Serie de detectores (copas de Faraday) y amplificadores. Sistema de bombeo.

Fundamento de detección. 12C16O18O (46) 13C16O16O (45) CO2 12C16O16O (44) +CO2

Ionización de la muestra. Energía cinética: e.V=1/2mv2, Fuerza centrífuga= m.v2/r Fuerza centrípeta= H.e.V Donde: e: carga del ión. V: gradiente de potencial. m: Masa del ión. v: velocidad del ión. H: campo magnético.

Sistema de detección de iones. VFC: voltage-to-frecuency convertes. Transforman la corriente analógica de los iones en “pulsos”. Estos pulsos son alimentados a un contador para un tiempo de integración pre- seleccionado. Al final de cada intervalo de integración, la computadora “lee” el número de cuentas y calcula la relación (ratios) de la corriente iónica.

Unidades de medida de la abundancia isotópica. R es la relación entre el número de isótopos pesados y ligeros existentes en la muestra. Por ejemplo: 13C/12C Las variaciones en la abundancia isotópica encontradas en la naturaleza son muy pequeñas, por lo tanto se deben utilizar unidades de medida acordes a esta circunstancia. 1 Delta (δ 0/00 ) = Ratiomuestra – Ratioreferencia x 1000 Ratio Referencia 2. Átomo % = no. de átomos de C13 no. de átomos de C13 + no. de átomos de C12

Patrón para el caso del 13C/12C Cada laboratorio calibra la muestra de referencia que utiliza con patrones internacionales, que prepara y distribuye fundamentalmente la Agencia Internacional de Energía Atómica (AIEA), con sede en Viena. A la relación isotópica de los patrones básicos se les atribuye un valor cero por definición. Patrón para el caso del 13C/12C P.D.B fósil del grupo de los belemnites de la formación geológica Pee Dee de Carolina del sur: para el δ13C.

Y recuerde, no nos defraude con el fraude! ¡Muchas Gracias por su atención! Y recuerde, no nos defraude con el fraude!