Biología Molecular en asistencia e investigación Conferència donada per Sílvia Pairet als alumnes de 2on de CFGS de Laboratori a l’IES Pedraforca (26-11-09) Hospital del Mar PRBB

Y después del CFGS, ¿Qué? Tenemos varias opciones: - Seguir estudiando una carrera: enfermería, fisioterapia, biología, biotecnología, medicina, farmacia... - Estudiar otro ciclo formativo: anatomía patológica - Ponernos manos a la obra :

Dónde podemos trabajar... Laboratorios Privados Tarea asistencial Centros Hospitalarios : Diagnóstico y seguimiento Laboratorios de investigación : Investigación básica conocer los fundamentos Investigación traslacional  práctica clínica

El técnico de laboratorio 3 tipos de técnicos: 1) El técnico que se especializa 2) El técnico ayuda de manera general en el laboratorio 3) El técnico asociado a un proyecto

Esquema Bases de la Biología Molecular Biología del Cáncer El laboratorio de Biología Molecular Fundamentos de las técnicas

Bases de la biología molecular Biología del Cáncer El laboratorio de Biología Molecular Fundamentos de las técnicas

El genoma Los cromosomas están formados por ADN que contiene toda la información genética de una célula. Los genes determinan nuestro código genético.

El genotipo nucleótidos constituye la cadena de ADN y Es el contenido genético de un individuo en forma de ADN La secuencia de nucleótidos constituye la cadena de ADN y el conjunto de genes de un organismo

El fenotipo Las características físicas de cada persona vienen determinadas por nuestro código genético El Fenotipo es la expresión del Genotipo de cada persona individualmente

Un repaso a la molécula de ADN Azúcar + Base Nitrogenada Grupo fosfato

Codón

Proteína CODÓN AMINOÁCIDO .

¿Qué información nos están dando los genes? Al formar una frase lo que hacemos es enlazar un conjunto de palabras : Sehr angenehm. Es tut mir leid. Para poder descifrar la información que contiene necesitaremos traducirlo. En el código genético, este paso sería conocido como: Dogma Central de la Biología

Síntesis de proteínas Una enzima sintetiza un ARNm que mantiene la información de la secuencia de ADN para formar una proteína. Dicha proteína está expresando la información contenida en los genes de una célula determinada ADN ARN polimerasa

Expresión genética La insulina es el resultado de la información codificada que contenía el ADN. Sin la correcta intervención de todos estos componentes, no tendríamos la Insulina como expresión de la información genética.

Todas las células de un individuo tienen los mismos genes 99% homología Fenotípicamente, son muy diferentes…Porqué?

Expresión génica Es la combinación de qué genes están activos y cuáles inactivos lo que hace que cada célula sea diferente Expresión Genes inactivos

Biología del cancer Bases de la Biología Molecular Biología del Cáncer El laboratorio de Biología Molecular Fundamentos de las técnicas

Un problema de frenos y acelerador Cáncer: Un problema de frenos y acelerador Enfermedad genética producida por la mutación de determinados genes en una célula determinada. 2 tipos de genes implicados en el cáncer... Oncogenes Genes supresores de tumores

Mutación Alteración de la secuencia del ADN original. Esto provoca cambios en la información genética del individuo.

Oncogenes Cuando estos genes se expresan más de la cuenta, En condiciones normales hacen que la célula avance en su ciclo y se divida. Si están hiperactivados debido a una mutación, la célula se reproduce sin control. Aceleradores Cuando estos genes se expresan más de la cuenta, pueden causar cáncer.

Genes supresores de tumores Regulan el ciclo de división celular, arreglan anomalías ADN y si la célula tiene una lesión en el ADN apoptosis Mutados, la célula es incapaz de suicidarse y continúa dividiéndose de manera defectuosa Frenos Cuando estos genes no se expresan, pueden causar cáncer

El laboratorio de biología molecular Perspectivas de futuro Bases de la Biología Molecular Biología del Cancer El laboratorio de Biología Molecular Fundamentos de las técnicas

Biología molecular: Estudio de los procesos que se desarrollan en los seres vivos desde un punto de vista molecular.

OBJETIVO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR (I) Conocer: Cómo se regulan los genes Cómo funcionan las proteínas resultantes Cómo se alteran en situaciones patológicas específicas . Translocación

OBJETIVO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR (II) Para hacer: Un diagnóstico adecuado Acciones terapéuticas curativas (tratamientos dirigidos a la alteración molecular) Permitir el diseño de pautas preventivas (seguimiento del paciente)

Diagnóstico de la LMC (I) Esta enfermedad presenta una alteración molecular debido a la translocación de 2 cromosomas, que dan lugar al cromosoma Filadelfia.

Diagnóstico de la LMC (II) El gen ABL es un proto-oncogén que actúa de forma normal como un acelerador en la célula. Translocación La proteína BCR-ABL actúa como acelerador del ciclo celular haciendo que las células se dividan de forma descontrolada e inhibiendo la reparación por daño al ADN

Diagnóstico de la LMC (III) Si se detecta la presencia de esta alteración molecular podemos corroborar el diagnóstico con la ayuda de otros criterios Activación del gen Existen tratamientos con fármacos que van dirigidos a bloquear la proteína que se activa por la fusión de este gen BCR-ABL, y de esta manera evitar la proliferación descontrolada Fármaco que impide la activación del gen

Diagnóstico de la LMC (IV) La pauta preventiva se realizaría comprobando la cantidad de copias del gen durante el seguimiento del paciente para determinar si este gen sigue expresándose o no. Gráfica del seguimiento del paciente

Técnicas de biología molecular Bases de la Biología Molecular Biología del cáncer El laboratorio de Biología Molecular Fundamentos de las técnicas de Biología Molecular

Técnicas Moleculares para el Diagnóstico de la LMC 1. Extracción de ácidos nucleicos 2. Cuantificación 3. RT-PCR 4. PCR Convencional 5. Secuenciación Directa 6. PCR Cuantitativa

Recepción de muestras Recepción de muestras : SP, MO, Tejido, Citologías Extracción de ADN y/o ARN Valoración de la calidad Diferentes técnicas en función de los estudios relacionados con las diferentes neoplasias

Empieza el juego... Densidad pH En primer lugar separamos las células que nos interesan del resto mediante centrifugación por gradientes de densidad. Después realizaremos la desnaturalización de los ácidos nucleicos y su purificación del resto de componentes celulares rompiendo la pared celular con componentes químicos. Y en tercer lugar provocaremos la precipitación de los ácidos nucleicos. Normalmente jugamos con la densidad y el pH de la muestra y de los componentes químicos que utilizamos. Finalmente el pellet celular se resuspende en el tampón y a la concentración requeridos.

Separación de células 1. Separación de las células que nos interesan mediante centrifugación por Gradientes de densidad. Los componentes de la mezcla se reparten en diferentes fases en función de la densidad y de la afinidad por los componentes químicos que utilizamos

Obtención de los ácidos nucleicos 2. Desnaturalización de los ácidos nucleicos. Se provoca la ruptura de la pared celular para que el ADN quede libre en la mezcla 3. Purificación del resto de componentes mediante centrifugación

Precipitación de los ácidos nucleicos 3. Precipitación de los ácidos nucleicos para formar un pellet celular que resuspenderemos en un tampón adecuado y a una concentración óptima

Valoración calidad/pureza El Espectrofotómetro mide la absorbancia de la luz a través de la muestra a una longitud de onda determinada RATIO: Abs 260/280 Concentración (ng) de ácidos nucleicos Restos de proteínas y alcoholes

Técnicas Moleculares para el Diagnóstico de la LMC 1. Extracción de ácidos nucleicos 2. Cuantificación 3. RT-PCR 4. PCR Convencional 5. Secuenciación Directa 6. PCR Cuantitativa

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Es como hacer un caldo... . + =

PCR (I) 1. DNA MOLDE. Segmento de ADN de doble cadena que contiene la secuencia diana que queremos amplificar 2. PRIMERS. Pequeños fragmentos de ADN de cadena simple. Complementarios a los extremos flanqueantes del ADN molde. Marcarán el punto de partida y delimitarán la zona de ADN a amplificar

PCR (II) A C G T 3. dNTPs. Suplemento de nucleótidos. Sustrato que usará la Polimerasa cuando produzca el nuevo ADN 4. DNA POLIMERASA. (Taq Polimerasa) Enzima que produce las copias de ADN 5. Tampón y MgCl2 . Adición de sales y un tampón que mantenga el pH adecuado en la mezcla

Veamos que pasa dentro del caldo...

Ciclos de amplificación

Desnaturalización La muestra se lleva a una temperatura de 94-96°C para que se rompan los puentes de hidrógeno y las dos cadenas del ADN molde se separen

Hibridación Los primers o cebadores que hemos añadido en la muestra actúan a una temperatura de entre 50 y 70ºC para unirse uno por cada extremo a las cadenas de ADN molde de manera complementaria. De esta manera delimitarán la zona a amplificar

Extensión La ADN polimerasa actúa a 72ºC para que se realice la extensión de las cadenas de ADN por complementariedad de bases entre los dNTPs y la cadena molde

Y esto es lo que ocurre...

Original DNA target region Thermal cycle En 32 ciclos, al 100% de eficiencia, se crean más de mil millones de copias del ADN de interés!

Identificación de bandas Para visualizar el producto de la PCR utilizamos la electroforesis en gel de agarosa. Como conocemos el tamaño del gen a estudiar, visualmente podemos observar si está o no presente en la muestra.

PCR enTiempo Real Es una variante de la PCR que permite cuantificar el producto de la amplificación. Añadimos un fluorocromo que emitirá una fluorescencia con cada copia del ADN. Esto nos indicará si el gen está presente o no en la muestra, y de ser positivo, si se encuentra en mayor o menor cantidad PCR +

MUCHA SUERTE!!