LIC. NUTRICIÓN QUÍMICA BIOLÓGICA 2014

PROGRAMA ANALITICO Y/O DE EXAMEN LIC. NUTRICIÓN QCA. BIOLÓGICA PROGRAMA ANALITICO Y/O DE EXAMEN  Tema 1: Introducción a la Bioquímica de la Nutrición. Objeto de estudio. Relación con otras ramas de las ciencias biológicas y de la salud. Compuestos constituyentes de la materia viva. Función de los nutrientes y otros componentes dietéticos en la nutrición Concepto de Metabolismo. Anabolismo y catabolismo. Vías, ciclos y cascadas metabólicas. Enzimas. Caracteres generales. Nomenclatura y clasificación. Coenzimas. Cinética enzimática. Factores que afectan la actividad enzimática: temperatura, pH, concentración de enzima y concentración de sustrato. Ecuación de Michaelis-Menten. Inhibición de enzimas: competitiva y no competitiva. Regulación enzimática: compartimentalización, enzimas alostéricas, modificación por unión covalente. Isoenzimas. Zimógenos. .

¿Cómo se mide la Actividad de una Enzima? La Actividad de una enzima puede determinarse midiendo La cantidad de producto que se forma ó La cantidad de sustrato que se consume En un tiempo dado En una mezcla que contenga todos los factores requeridos para la reacción ¿Cómo se mide la Actividad de una Enzima? [S] + E [ ES ] E + [P]

mmol de S transformados mmol de S transformados/min ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Formas de expresar la Actividad de una Enzima Unidades Internacionales (UI) Cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 mmol de S por minuto Actividad Molecular ó Numero de Recambio Moléculas de S convertibles en P por unidad de tiempo y por molécula de enzima U.I.E. = mmol de S transformados min (1 katal = 6 x 107 U.I.E.) Actividad molecular = Mol de enzima mmol de S transformados/min

Actividad enzimática por cada miligramo de proteína Actividad Específica Actividad enzimática por cada miligramo de proteína presente en la muestra A B + Prot.Tot: ∑ + Prot.Tot: ∑ + Prot.Tot: ∑ D Actividad específica U.I.E. mgr de proteína = Activ. Enzimática Prot. totales Prot.Tot: ∑

en las reacciones enzimáticas? ¿Qué cambios ocurren en las reacciones enzimáticas? Las transformaciones químicas en los sistemas biológicos se acompañan de cambios energéticos. Conocer estos cambios permite entender la lógica y sentido del METABOLISMO celular. Los seres vivos requieren y utilizan la energía de su entorno, para realizar trabajo.

Reacción NO espontánea Energía libre (G) (Energía de Gibbs): es la fracción de la energía liberada en las reacciones bioquímicas que es disponible para realizar trabajo útil (mecánico, químico, osmótico) Si se determina el cambio de G (DG), se puede predecir el sentido de una reacción química, si ocurrirá espontáneamente o no. Si los Reactivos tienen mayor energía que los Productos Si G del sistema disminuye (- DG) La reacción es exergónica, se libera energía durante la reacción Si los P tienen más energía que los Reactivos Si G del sistema aumenta (+DG) La reacción es endergónica, necesita energía para que ocurra Reacción espontánea Reacción NO espontánea

Diagrama de coordenadas de una reacción catalizada y sin catalizar Energía Libre (G) Estado de transición o de activación Energía de activación de la reacción NO catalizada Energía de activación de la reacción CATALIZADA (por una Enzima) Enz-S Enz-P S P Progreso de la reacción

Las enzimas actúan disminuyendo la Ea Energía de activación (Ea): es la energía necesaria para alcanzar el estado activado El estado de transición o barrera de activación, representa los cambios que se generan en la molécula del S. Es por esto que las reacciones sin catalizar tienden a ser muy lentas. Todas las moléculas biológicas son muy estables al pH neutro, temperatura suave y ambiente acuoso en el interior de las células. Todas las reacciones químicas celulares se llevan a cabo porque las enzimas actúan disminuyendo la barrera energética entre el S y el P. Las enzimas actúan disminuyendo la Ea

Factores que afectan la Actividad Enzimática Concentración de Enzima pH Temperatura Concentración de Sustrato

Efecto de la concentración de Enzima sobre la Actividad Enzimática Concentración saturante de sustrato, pH y T°C constantes [E] Vo Se establece la relación entre Cantidad y Actividad de enzima Velocidad de reacción directamente proporcional a la concentración de enzima

Los cambios del pH del medio afectan el estado de ionización de grupos funcionales de las moléculas de E y S. Para la formación del [ES] es necesaria una correcta distribución de las cargas en ambas moléculas pH óptimo Concentración de sustrato, E y T°C constantes 6 8 pH óptimo es aquel en el cual el estado de disociación de los grupos esenciales es el más apropiado para interaccionar en el complejo ES

Ejemplos de enzimas con diferentes pH óptimo

Influencia de la Temperatura sobre la Actividad Enzimática Concentración de S, E y pH constantes actividad por de la temperatura Temperatura óptima Temperatura(°C) Actividad enzimática Desnaturalización por temperatura Actividad

Influencia de la concentración de Sustrato sobre la velocidad inicial [E], pH, T°C: constantes Curva hiperbólica

Ecuación de Michaelis – Menten Cinética del estado estacionario Ecuación de Michaelis – Menten Reacción de orden cero Km = [S] cuando V0 = ½ Vmáx Reacción de 1° orden Hablar de Km y orden de la reaccion V0= Velocidad inicial de la reacción Vmáx= Velocidad Máxima Km= constante de Michaelis [S]= concentración del sustrato V0= Velocidad inicial de la reacción Vmáx= Velocidad Máxima Km= constante de Michaelis [S]= concentración del sustrato

Ecuación de Michaelis – Menten Constante de Michaelis (Km) = Km, Constante de Michaelis Constante de Michaelis (Km) Es característica de una enzima y su sustrato particular Refleja la afinidad del sustrato por la enzima, en relación inversa: menor Km mayor afinidad E por el S Km es numéricamente igual a la concentración del sustrato que corresponde a una velocidad de reacción igual a la mitad de la velocidad máxima. En condiciones definidas de pH, T°C, Km tiene un valor fijo para cada enzima y sirve para caracterizarla. Km = [S] cuando V0 = ½ Vmáx

Gráfica doble recíproca o de Lineweaver-Burk Ordenada al Origen = 1 / Vmáx Pendiente = Km / Vmáx Intersección con eje X = - 1 / Km

INHIBICIÓN ENZIMÁTICA COMPETITIVA NO COMPETITIVA (ACOMPETITIVA) INHIBICION REVERSIBLE POR ENLACE COVALENTE INHIBIDOR SUICIDA DIFP Quimotripsina INHIBICION IRREVERSIBLE Penicilina Transpeptidasa Alopurinol Xantina oxidasa

INHIBICION REVERSIBLE INHIBICION COMPETITIVA E E + S ES E + P I EI I + [E] [I] [EI] Ki = S     KM ap = Km(1 + [I]/Ki)

Ejemplo de Inhibidor competitivo Succinato + FADH2 Fumarato + FAD+ Succinato deshidrogenasa COO- (CH2)2 COO- CH2 Malonato Succinato

Inhibidor Competitivo sobre la Actividad Enzimática Gráfica de M-M Efecto de un Inhibidor Competitivo sobre la Actividad Enzimática Km = Vmáx Km Km ap [S] 1/v Gráfica de L-B 1/[S] -1/Km -1/Kmap

INHIBICION NO COMPETITIVA S E + S ES E + P + I EI + I ESI I E S I + S

Inhibidor No Competitivo sobre la Actividad Enzimática Km [S] v Gráfica de M-M Efecto de un Inhibidor No Competitivo sobre la Actividad Enzimática = Km Vmáx -1/Km 1/[S] 1/v Gráfica de L-B Vmáx ap.= Vmax.s/I      Km(1 + [I]/Ki)

Características de los diferentes tipos de inhibición reversible Tipo de El Inhibidor Efecto Efecto inhibición se une a s/Vmáx s/Km Competitiva E Ninguno Aumenta No competitiva E y ES Disminuye Ninguno Km c/I. = Km s/Inh. x (1+ [I]/Ki) Vmáx c/I= Vmáx. s/Inh. / 1 + [I]/ Ki

Acción de inhibidores a distinta concentración COMPETITIVA NO COMPETITIVA Pendiente = Km / Vmáx

INHIBICION IRREVERSIBLE Por unión covalente del inhibidor - Acetilcolinesterasa - Quimotripsina Enzima inactivada Diisopropilfluorfosfato (DFP)

INHIBICION IRREVERSIBLE Inhibidor suicida Se asemeja a la estructura del S. Se une al sitio activo de la enzima y ésta cataliza la modificación del inhibidor a otro compuesto que permanece unido a la enzima. Produce un cambio permanente sobre la enzima. Ej: El ALOPURINOL es un inhibidor suicida que actúa sobre la enzima xantina oxidasa (degradación de purinas). Se forma el oxopurinol el cual queda unido a la enzima.

REGULACIÓN DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS REGULACION DE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS ENZIMAS ALOSTERICAS REGULACION POR PROTEINAS REGULACION POR PROTEOLISIS POR MODIFICACIÓN COVALENTE ENZIMAS INDUCIBLES REGULACION DE LA SINTESIS DE LAS ENZIMAS

MODULADORES POSITIVOS MODULADORES NEGATIVOS ENZIMAS ALOSTÉRICAS Enzima 1 2 3 4 Enzima 1 ENZIMA ALOSTERICA MODULADORES POSITIVOS MODULADORES NEGATIVOS

PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS ALOSTÉRICAS Poseen un sitio de unión a un metabolito regulador o sitio alostérico, diferente al sitio activo. (Allo: otro, stereo:lugar) La unión del metabolito a la enzima es de carácter reversible y no covalente. En general poseen dos o mas sitios reguladores. La mayoría posee dos o mas cadenas polipeptídicas o subunidades. En general tienen un comportamiento cinético sigmoideo La regulación es inmediata

MODULADORES POSITIVOS MODULADORES NEGATIVOS ENZIMAS ALOSTÉRICAS MODULADORES POSITIVOS MODULADORES NEGATIVOS

CINETICA DE UNA ENZIMA ALOSTÉRICA Curva Sigmoidea

EJEMPLOS DE ENZIMAS ALOSTÉRICAS Hexoquinasa, Fosfofructoquinasa y Piruvato Quinasa Vía glicolítica AcetilCoA carboxilasa Biosíntesis de lípidos Aspartato Transcarbamilasa Biosíntesis de nucleó tidos pirimidínicos Glutamato Deshidrogenasa Degradación de aminoácidos Citrato sintasa, isocitrato y a-cetoglutarato deshidrogenasas Ciclo de Krebs

Ej. Regulación Alostérica Actividad de Aspartato transcarbamilasa (ATCasa) Aspartato (mM)

REGULACIÓN POR MODIFICACIÓN COVALENTE POR UNION COVALENTE DE GRUPOS (FOSFATOS , ADENILATOS, ETC.) INTERVIENEN ENZIMAS: QUINASAS, FOSFATASAS LA UNION DEL GRUPO PUEDE ACTIVAR O INHIBIR LA ENZIMA POR UN CAMBIO CONFORMACIONAL ES INMEDIATA Fosforilación Enzima Enzima Fosfoadenilación ADP-Ribosilación

REGULACIÓN POR MODIFICACIÓN COVALENTE Fosforilasa fosfatasa 2 Pi 2 H2O Fosforilasa quinasa ATP ADP Fosforilasa b P -O-CH2 CH2- O- P Fosforilasa a (menos activa) (Cadena lateral de Ser) CH2- HO HO-CH2

REGULACIÓN POR PROTEÓLISIS Por eliminación de una cadena peptídica, enzimas inactivas se convierten en enzimas activas y viceversa. Las enzimas digestivas: pepsinógeno y quimotripsinógeno se convierten en las enzimas activas pepsina y tripsina. Suele ocurrir una activación secuencial produciéndose una cascada de activaciones. Ej. Coagulación sanguínea. ZIMÓGENOS

ISOENZIMAS Diferentes formas moleculares de una misma enzima. Son sintetizadas por genes diferentes Tienen diferente composición aminoacídica por lo que pueden separarse por electroforesis. Catalizan la misma reacción, actuando sobre el mismo sustrato para dar el mismo producto

Lactato deshidrogenasa (LDH) Presenta 5 isoenzimas con distinta composición en cuanto a sus subunidades y c/u es específica de un tejido. H4 H3M H2M2 HM3 M4 M > Músculo H > Corazón Piruvato + NADH Lactato + NAD+

Ejemplo de isoenzimas: Glucoquinasa y Hexoquinasa Actividad enzimática Km. hexq Km. glucq [glucosa mmol/l Cuando la concentración de glucosa en sangre es baja solo actúa la hexoquinasa. Cuando es elevada, por ejemplo luego de una comida, actúan ambas: hexoquinasa y glucoquinasa.

BIBLIOGRAFÍA   -BLANCO, A., "Química Biológica", Ed. El Ateneo, 9° Edición, Bs.As, 2011 -CHAMPE, HARVEY, FERRIER, “Bioquímica”,Ed Mac Graw- Hill Interamericana, 3° Edición. 2006 -LEHNINGER, A.L., NELSON, D., COX, M., "Principios de Bioquímica", Editorial Omega, S.A., 4° Ed., 2006. Reimpresión año 2008.