GENERALIDADES DE LAS ENZIMAS

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1 GENERALIDADES DE LAS ENZIMAS

2 Enzimas Son moléculas catalíticas (proteínas) que incrementan la velocidad de reacciones químicas que son energéticamente posibles. No son consumidas durante la reacción. Virtualmente todas las reacciones del organismo son mediadas por enzimas.

3 PROPIEDADES GENERALES
Mayor velocidad de reacción Es 106 a 1012 veces más alta que reacciones no catalizadas Condiciones de reacción moderadas Temperaturas inferiores a 100°C, a presión atmosférica y pH casi neutro Mayor especificidad de reacción Grado de especificidad mayor, rara vez tienen productos secundarios Capacidad de regulación Varían en respuesta a concentraciones de sustancias distintas de sus sustratos (control alostérico, modificación covalente de enzimas y variación de cantidades de enzimas sintetizadas)

4 Nomenclatura Nombre recomendado (es el más común): tienen el subfijo “asa” ligado al substrato de la reacción. Ejemplo: glucosidasa y ureasa. Nombre sistemático: las enzimas se dividen en 6 clases principales. se especifica el nombre del sustrato seguido de la reacción catalizada y el subfijo asa. Ejemplo: D-glyceraldehído 3-fosfato NAD+ oxidorreductasa

5 CLASES IMPORTANTES DE ENZIMAS

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8 ZIMÓGENOS Precursores inactivos (proenzimas) de las enzimas proteolíticas La activación secuencial de las proenzimas permite la generación rápida de grandes cantidades de enzimas activas en respuesta a diversas señales fisiológicas. Ejemplo: serina proteasas que conducen a coagulación sanguínea

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10 Isoenzimas (o isoformas)
Enzimas que difieren en su secuencia de aminoácidos, pero que poseen la misma actividad catalítica, es decir catalizan la misma reacción. En general, las isoenzimas representan enzimas de diferentes genes cuyos productos catalizan la misma reacción. Estas enzimas generalmente tienen diferentes parámetros cinéticos (diferentes valores de KM) o diferentes propiedades reguladoras.

11 Propiedades de las enzimas
Sitio activo Alta especificidad Alta eficiencia catalítica Holoenzimas Sistema de regulación Localización específica dentro de la célula (compartamentalización)

12 1. Sitio activo Cadenas laterales de aminoácidos que forman una superficie tridimencional (“hendidura”) donde se unen los substratos. La complementariedad entre la enzima y el sustrato depende de fuerzas no covalentes: grupos hidrófobos, puentes de hidrógeno, interacciones electrostáitcas, etc. Es el lugar en donde se lleva a cabo la catálisis Se forma un complejo ES (enzima sustrato) que posteriormente se convierte en un complejo EP (enzima-producto) y finalmente se disocia en la E (enzima) y el P (producto).

13 2. Eficiencia catalítica
Altamente eficientes, ya que son de más eficientes que las reacciones no catalizadas. Kcat = es el número de recambio que es el número de moléculas de sustrato convertidas en producto por una molécula de enzima en una unidad de tiempo cuando la enzima esta saturada con el sustrato.

14 3. Especificidad Son altamente específicas, ya que interaccionan con uno o unos cuantos substratos y sólo catalizan un tipo de reacción química. El conjunto de enzimas elaborado por una célula particular determina en que vía metabólica está involucrada.

15 4. Holoenzima Enzima activa con su componente no proteico.
Apoenzima→ enzima inactiva sin el cofactor.

16 Grupos no protéicos: cofactores
Algunas enzimas requieren de otras moléculas no protéicas para llevar a cabo su actividad enzimática a estos componentes se les llama cofactores. Los cofactores pueden ser iones metálicos → Zn2+, Fe2+ Cu2+ Cuando el cofactor es una molécula orgánica pequeña, se le llama coenzima . Cosustrato : coenzima se asocia en forma transitoria con la enzima (ejemplo: NAD+ y NADP+). Grupo prostético: coenzima se asocia permanentemente a la enzima (ejemplo: FAD).

17 Muchas vitaminas son precursores de coenzimas

18 5. Regulación Puede incrementarse o disminuirse la actividad enzimática debido a las necesidades de la célula.

19 6. Compartimentalización
La mayoría de las enzimas están localizadas en orgánulos específicos, esta compartimentalización sirve para aislarlas de otras reacciones y tener un ambiente favorable para la reacción.

20 MECANISMO DE ACCIÓN El estudio cuantitativo de la catálisis enzimática se denomina cinética enzimática y proporciona información sobre las velocidad de la reacción, afinidad de las enzimas por los sustratos y efectos de los inhibidores. Este conocimiento mejora la comprensión de la regulación de las rutas metabólicas y posibilita la mejora de fármacos más adecuados. Hay dos puntos importantes de considerar: Los cambios de energía que ocurren durante la catálisis. Como el sitio activo facilita la catálisis.

21 Complejo Enzima –Sustrato
CINÉTICA ENZIMÁTICA Sustrato Enzima Complejo Enzima –Sustrato Enzima + Producto Modelo Michaelis-Menten Constante catalítica o número de recambio (kcat): número de moléculas de sustrato que pueden convertirse en producto x molécula de enzima y por unidad de tiempo Proporción de ES limita velocidad (v) de enzima El sustrato S se une a la enzima E formando un intermediario esencial, el complejo enzima.-sustrato ES que luego reacciona en la superficie de la enzima se descompeone en E + P el producto. El modelo presupone que E S y ES se encueentran todos en equilibrio rápido uno respecto a otro, de modo que se alcance rápidamente una concentración estable de ES y que la descomposición del complejo ES en E + P sea el paso limitante de la velocidad de la catálisis.

22 1. Energía libre de activación
En todos las reacciones hay una barrera energética entre los reactantes y los productos. Durante la conversión de una molécula A, a un producto B, hay cambios de energía, pasando por un estado de transición “T” : La energía libre de activación, es la diferencia entre la energía del reactante y “T”.

23 Efecto de las enzimas sobre la energía de activación
Las enzimas son catalizadores que permiten que las reacciones se realicen más rápidamente ya que disminuyen la energía de activación requerida para la reacción. En ausencia de la enzima, sólo una pequeña proporción de las moléculas reactantes posen suficiente energía para alcanzar al estado “T”. La combinación del sustrato y enzima genera un nuevo camino de la reacción donde la energía libre del estado de transición es menor que aquél en la ausencia de la enzima.

24 2. Papel del sitio activo en la catálisis
El sitio activo además de ser el sitio de unión al substrato, también participa en el proceso catalítico, ya que restringe los movimientos y las conformaciones del sustrato orientándolo en forma óptima para que se lleve a cabo la reacción. El sitio activo provee grupos catalíticos que aumentan la probabilidad de que se alcance el estado de transición lo que reduce la energía de activación necesaria para que se produzca la reacción hasta el producto.

25 En las reacciones catalizadas por enzimas al disminuir la energía de activación se incrementa la velocidad de la reacción. Las enzimas no alteran el equilibrio de la reacción, sólo aumentan la velocidad hacia el equilibrio, el cual se alcanza en segundos o minutos.

26 Factores que afectan la velocidad de una reacción
Concentración del sustrato Temperatura pH

27 1. pH La concentración de H+, afecta la velocidad de la reacción. Usualmente se requiere que la enzima y el sustrato tengan grupos químicos específicos en estado ionizado o no ionizado para interactuar. Ejemplo: se puede requerir que el grupo amino de la enzima este protonado (-NH3+), y a pH alcalino este grupo es desprotonado, por lo que se requiere un pH básico. pH extremos pueden desnaturalizar las enzimas. El pH óptimo varía en las diferentes enzimas. Ejemplo: pepsina pH óptimo 2

28 2. Temperatura La velocidad de la reacción se incrementa con la temperatura, hasta que se alcanza la máxima velocidad, aunque a mayor aumento suele degradarse. Este incremento se debe al aumento de el número de moléculas que tienen suficiente energía para pasar la barrera energética para formar los productos de la reacción.

29 3. Concentración del sustrato
La velocidad (Vo) de una reacción es el número de moléculas de substrato convertidas en producto por unidad de tiempo (µmol/minuto). La velocidad se incrementa con la concentración del substrato hasta alcanzar una máxima velocidad (Vmax). La velocidad de la reacción se detiene a altas concentraciones de substrato y es el reflejo de la saturación de todos los sitios activos de las moléculas de enzima presentes en ese momento.

30 Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de reacción
La mayoría de las enzimas muestran una cinética de Michaelis-Menten: Al graficar la velocidad inicial (Vo) de reacción contra la concentración de substrato se obtiene una curva hiperbólica.

31 Modelo de Michaelis- Menten
La enzima se combina irreversiblemente con el substrato formando un complejo ES, posteriormente se libera un producto y la enzima K1, k2 y k2 son constantes de velocidad. La mayoría de las reacciones catalizadas por enzimas se rigen bajo este modelo . La medida de la velocidad de la reacción catalizada por una enzima es bajo las condiciones óptimas de la enzima (pH, temperatura, cofactores, etc).

32 Ecuación de Michaelis-Menten
Describe como la velocidad de la reacción varía con la concentración del sustrato: Suposiciones: La concentración del sustrato [S], es mucho mayor que la concentración de la enzima [E], por lo que el porcentaje del sustrato unido a la enzima en cualquier momento es pequeño. [ES] no cambia con el tiempo, es decir, la velocidad de formación de ES es igual a la de su degradación (E+P), se le llama suposición de estado estacionario. Se utiliza la velocidad inicial de reacción (Vo), ya que la velocidad de la reacción se mide tan pronto como el substato y la enzima se mezclan, por lo que la concentración de producto es muy pequeño y la reacción de P → S puede ignorarse. Vo: velocidad de la reacción inicial Vmáx: velodidad máxima Km: es la constante de Michaelis-Menten [S]: concentración de sustrato

33 CONCLUSIONES 1. CARACTERÍSTICAS DE Km
Km es característica de una enzima y su sustrato particular, refleja la afinidad de la enzima por el substrato. Una Km pequeño refleja una alta afinidad de la enzima por el substrato, porque se requiere una baja concentración de substrato para saturar la enzima a la mitad, esto es para que alcance la velocidad ½ Vmax. Una Km grande refleja una baja afinidad de la enzima por el substrato porque se requiere una alta concentración de substrato para saturar la enzima a la mitad.

34 2. RELACIÓN DE LA VELOCIDAD DE CON LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA
La velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración de la enzima a cualquier concentración de substrato. Ejemplo: si la concentración de la enzima se reduce a la mitad, la velocidad inicial de reacción (Vo), al igual que la velocidad máxima (Vmax) se reducen a la mitad.

35 3. ORDEN DE LA REACCIÓN Cuando [S] es mucho menor que la Km, la velocidad de la reacción es proporcional a la concentración del sustrato, se dice entonces que la velocidad de la reacción es de primer orden con respecto a la concentración de sustrato. Cuando [S] es mucho mayor que la Km la velocidad es constante e igual a Vmax, entonces, la velocidad de la reacción es independiente de la concentración del sustrato y se dice que la velocidad de la reacción es de orden cero con respecto a la concentración del sustrato.

36 REPRESENTACIÓN DE Lineweaver-Burk
La ecuación de Lineweaver-Burk se utiliza para una detminación más exacta de Km y Vmax. Se transforman los datos, la ec de Michaelis-Menten (una hipérbola), se reordena teniendo su inversa: en su inversa: Cuando se grafica el inverso de Vo= 1/Vo contra el inverso de [S]= 1/ [S], se obtiene una linea recta llamada grafico de Lineweaver-Burk.

37 Grafica de Lineweaver-Burk
Esta línea se puede usar para calcular Km y Vmax y para determinar el mecanismo de acción de los inhibidores enzimáticos. La intersección en el eje de las “x” es 1/Vmax La intersección en el eje de las “y” es 1/Km

38 INHIBICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
La función catalítica de las enzimas está regulada por inhibidores (disminuyen la velocidad de reacción), esenciales en la regulación del metabolismo Inhibidores irreversibles (enlaces covalentes) y reversibles (no covalentes) Algunas drogas y toxinas actúan como inhibidores y bloquean rutas metabólicas esenciales para las células

39 Inhibición irreversible y reversible
Un inhibidor irreversible se disocia muy lentamente de su enzima diana porque está estrechamente unido a la enzima mediante enlaces covalente o no covalentes (toxinas, drogas, etc.) La inhibición reversible está caracterizada por una disociación rápida del complejo enzima-inhibidor (E-I). Típicamente, los inhibidores forman enlaces no covalentes. La inhibición reversible se subdivide en: Inhibición competitiva Inhibición no-competitiva Acompetitiva

40 A. Inhibición competitiva
Se presenta cuando el inhibidor se une reversiblemente a la enzima en el mismo sitio que el sustrato normalmente ocuparía, por lo que compite con el substrato por este sitio.

41 A. Inhibición competitiva
Efecto sobre Vmax. A una concentración de sustrato suficientemente alta, se alcanza la Vmax observada en auscencia del inhibidor. Efecto sobre la Km. La Km se incrementa en prescencia del inhibidor. Efecto sobre Lineweaver-Burk: las gráficas de las relaciones inhibida y no inhibida cortan trasversalmente en el eje y en 1/Vmáx.

42 Fármacos con inhibición competitiva
Las estatinas (fármacos que disminuyen el colesterol) son drogas que inhiben un paso limitante en la síntesis de colesterol, que es catalizado por la HMG-CoA reductasa. Ejemplo: lovastatin (una estatina), es un análogo de la HMG-CoA y compite por el sitio activo de la HMG-CoA reductasa. Bajan los niveles plasmáticos de colesterol ya que se inhibe su síntesis de novo. HMG-CoA →hidroximetilglutaril CoA reductasa.

43 2. Inhibición No competitiva
El inhibidor y el sustrato se unen a sitios diferentes sobre la enzima. El inhibidor puede unirse sobre la enzima libre o bien en el complejo ES, evitando que la reacción ocurra. Tiene un efecto característico sobre la Vmax.

44 Inhibición No competitiva.
Efecto sobre Vmax: la inhibición no puede superarse por un incremento en la concentración del sustrato, por lo que estos inhibidores disminuyen la Vmax de la reacción. Efecto sobre Km: no afectan la unión del sustrato a la enzima, por lo que la enzima muestra la misma Km similar en presencia o ausencia del inhibidor. Efecto sobre Lineweaver-Burk: Vmáx aparentemente disminuye en presencia de un inhibidor no competitivo mientras que Km no se modifica

45 Inhibidores No competitivos
Ciertos insecticidas cuyo efecto neurotóxico es el resultado de su unión irreversible al sitio catalítico de la enzima. Ejemplo: insecticidas que actúan como inhibidores de la acetylcholinesterasa (enzima que degrada al neurotransmisor acetilcolina).

46 Inhibidor competitivo vs. no competitivo
Velocidad de reacción NO cambia Km aumenta Velocidad de reacción disminuye Km no varía

47 Inhibición acompetitiva
El I se une al complejo ES  EIS solamente, no a la enzima libre Esta inhibición es rara, decrecen los valores de Vmax y Km El aumento de la [S] acelera la rxn pero nunca como sin inhibidor La rxn puede retrasarse pero no impedirse Se presenta cuando hay mas de un sustrato en la reacción.

48 Fármacos que actúan como inhibidores enzimáticos
Muchas medicinas actúan como inhibidores. Al menos la mitad de los medicamentos más comunes en USA. Ejemplo: penicilina y amoxicilina. Inhiben a las enzimas involucradas en la síntesis de la pared celular de las bacterias

49 Regulación enzimática
La actividad enzimática puede regularse, activándose o inhibiéndose de acuerdo a las necesidades de la célula. Los principales mecanismos de regulación son: Control genético (síntesis de la enzima) Modificación covalente Efectos alostéricos Compartimentalización

50 A. Control genético La regulación de la cantidad de enzima se efectúa alterando la velocidad de su síntesis. Puede presentarse una inducción o una represión de la síntesis de la enzima, pero su eficiencia no se modifica. Principalmente son enzimas que se requieren en una etapa del desarrollo o bajo condiciones fisiológicas específicas (ejemplo: niveles altos de insulina en sangre como consecuencia de niveles muy altos de glucosa en sangre). Su efecto es lento, comparado con el efecto de los otros tipos de regulación.

51 B. Modificación covalente
Es una de las principales formas mediante las cuales se regulan los procesos celulares. Cambios en las enzimas por diversas modificaciones covalentes: Fosforilación y desfosforilación (principal) Metilación Acetilación Nucleotidilación (adición de nucleótido)

52 C. Efectos alostéricos Las enzimas alostéricas, generalmente están formadas por varias subunidades, con varios sitios activos los cuales presentan cooperatividad. Son reguladas por moléculas llamadas efectores, los cuales se les unen no covalentemente en un sitio diferente a su sitio activo. El efector alostético puede alterar la afinidad de la enzima por su substrato o afectar la máxima actividad catalítica de la enzima. Generalmente catalizan pasos iniciales limitantes de las vías metabólicas

53 Regulación alostérica.
Las enzimas alostéricas pueden ser inhibidas o estimuladas por sus efectores o moduladores, es decir, los efectores pueden ser positivos (aceleran la reacción), o negativos (disminuyen la reacción). Con respecto a su naturaleza los efectores pueden ser homotrópicos o heterotrópicos. 53

54 Efectores homotrópicos
Efector homotrópico: el mismo sustrato funciona como efector (por ej. la unión de un sustrato influye sobre la unión de otra molécula sustrato), generalmente son efectores positivos. Al unirse a un sitio de la enzima, la molécula sustrato aumenta las propiedades catalíticas de otros sitios de unión a otros sutratos, esto es, presentan cooperatividad. Estas enzimas muestran una curva sigmoidea cuando la velocidad de reacción (Vo) se grafica contra la concentración de sustrato [S]

55 Efectores heterotrópicos
Efector heterotrópico: el efector es diferente del sustrato de la reacción. Los efectores heterotrópicos pueden ser negativos o positivos. Ejemplo: Inhibición por Feed- back. En un paso irreversible (limitante), una enzima convierte el producto D en E, esta misma tiene un sitio alostérico que se une al producto final G. Cuando G se incrementa (porque no se consume tan rápidamente), el paso irreversible de la vía se inhibe.

56 Ejemplo: Glucólisis Efector negativo.
La fosfofructoquinasa-1 (FPK-1) tiene un sitio alostérico para ATP. En grandes concentraciones de ATP, la enzima se inhibe alostéricamente. Efector positivo: FPK-1 es alostéricamente activada por fructosa 2,6 bifosfato, siempre que aumente la concentración de AMP (condiciones de demanda energética). FPK-1

57 ALGUNAS ENZIMAS UTILIZADAS EN EL DIAGNÓSTICO CLÍNICO DE ENFERMEDADES
Tejido (s) Uso diagnóstico AST Corazón, músculo esquelético, hígado, cerebro Hepatopatía ALT Hígado Amilasa Páncreas, glándulas salivales Pancreatitis aguda, obstrucción biliar CK Músculo esquelético, corazón, cerebro Distrofia muscular, infarto de miocardio GGT Hepatitis, exceso de alcohol LDH Corazón, hematíes, hígado Linfoma, hepatitis Lipasa Páncreas Fosfatasa alcalina Osteoblasto Enfermedad ósea, tumores óseos Fosfatasa ácida Próstata Cáncer de próstata