Coeficiente volumétrico de transferencia de O2 (KLa) Alejandra Bosch Claudio Voget Claudia Prieto

Transporte de Oxígeno en un cultivo microbiano Baja solubilidad del O2 en agua (7 mg/l a 35°C) + Los microorganismos usan solamente el O2 disuelto El O2 es un macronutriente (10-4 M) El O2 debe ser suministrado permanentemente tratando que las burbujas queden temporalmente retenidas en el seno del líquido para que el O2 se transfiera a la fase líquida. -10 g/L levaduras -1000 mg O2/Lh -Si hay 8 mg disueltos en 25 segundos los consume MAYOR TRANSFERENCIA DE O2 MAYOR TIEMPO DE RETENCIÓN DE LAS BURBUJAS

Formas de suministrar O2 en un cultivo Sistemas aireados con agitación mecánica sin agitación mecánica -tanque agitado -air lift -erlenmeyer

y por difusión (∆ gradiente de concentración) Transferencia de oxígeno - Modelo de la película o del film estanco Transporte de los compuestos en un cultivo ocurre por el movimiento del fluido y por difusión (∆ gradiente de concentración) Líquido G-L Gas L-S S Célula Burbuja de aire 4 5 1 2 6 7 3 1- Difusión del seno del gas a la interfase gas-líquido. 2- Movimiento a través de la interfase G-L 3- Transporte convectivo en el seno del líquido 4- Difusión a través del film líquido estanco (interfase L-S) 5- Transporte a través de la membrana 6- Difusión intracelular hacia el sitio de la reacción química 7- Transporte y reacción química

PO2 = H . C* Ley de Henry (solubilidad de un gas) Ley de Fick Transferencia G-L . Modelo de la película Fase gaseosa X C* CL Seno de la fase líquida PO2 L Película líquida estanca La resistencia más importante es atravesar la interfase G-L PO2 = H . C* Ley de Henry (solubilidad de un gas) Ley de Fick Flujo por difusión No2: moles O2/área / tiempo D: coeficiente de difusión del O2 dCO2/dx: gradiente de concentración que impulsa la transferencia

RO2 velocidad de transferencia de O2 [moles O2/L/h] Transferencia G-L . Modelo de la película Si CL < C* KL=DO2/L KL=coeficiente de transferencia de materia moles O2/área / tiempo RO2=NO2 . a Área interfacial por unidad de volumen RO2 velocidad de transferencia de O2 [moles O2/L/h] KLa coeficiente volumétrico de transferencia de O2 depende de la difusividad (D) del oxígeno en el medio y la turbulencia del líquido (L)

KLa se determina globalmente Unidades: [h-1] Transferencia G-L . Modelo de la película Resumiendo - La concentración de oxígeno CL en el seno del líquido aumenta hasta alcanzar el valor de C*, de modo que la transferencia de O2 hacia el seno del líquido (NO2) se anula cuando C*=CL,cuando se anula el gradiente. - Para que la transferencia de oxígeno no se anule, el O2 debe ser permanentemente consumido ya sea por un microorganismo o una reacción química. KLa se determina globalmente Unidades: [h-1] El valor de KLa está directamente relacionado con la eficiencia de un biorreactor para transferir oxígeno.

FACTORES QUE AFECTAN LA TRANSFERENCIA DE O2 KLa (C*-C) RO2=KLa (C*-CL) KLa=D.a L Estado de agitación (agitación –aireación) Re=(nD2 ρ)/η n=rpm D=diámetro de las paletas ρ=densidad η=viscosidad A > agitación <L>KLa Antiespumantes > L <Kla Detergentes >L<KLa, pero >a>Kla Sustancias orgánicas Presión C*=HPO2 >P >C* Temperatura >T < C* >T >D 10°C-40°C: predomina >D, aum. RO2 >40°C: predomina < C*, dismin. RO2

FACTORES QUE AFECTAN EL KL Y EL KLa AGITACION: 1- aumenta el área de intercambio por ruptura de las burbujas aumenta área por unidad de volumen 2- Disminuye el espesor de la películas (L) por lo que aumenta el KL. AIREACION: aumenta el numero de burbujas  aumenta el a y disminuye el L. TEMPERATURA: afecta el coeficiente de difusión y la solubilidad (cte de Henry). VISCOSIDAD: a mayor viscosidad, mayor resistencia a la transferencia (ver número de Reinols) TENSIACTIVOS: afectan el área de trasferencia y el KL y el efecto global depende de la concentración burbujas mas pequeñas aumento del área y del KLa. aumento de la resistencia de la película  disminuye el KL SUSTANCIAS ORGANICAS : antiespumantes: disminuyen el KLa peptonas , micelio, biomasa : disminuyen el KLa alcoholes, cetonas y esteres: aumentan el KLa

Cómo seleccionar el KLa apropiado? -El tipo de célula: las bacterias, hongos, cél. animales crecen a distinta μ, por lo tanto tendrán distintas qO2. La concentración de biomasa final alcanzada. La susceptibilidad de las células a las fuerzas de corte. Tipo celular Xf (g/l) μ (h-1) KLa (h-1) Tipo de reactor Animal 0.5 0.01-0.04 1-25 Tubo ensayo inmóvil Vegetal 10-15 0.007-0.03 20-30 Tubo-erlen Levadura Hongo 10-30 0.2-0.6 100-1000 Erlen-reactor bacteria 10-20 0.6-1.4

Cómo seleccionar el sistema de cultivo apropiado? volumen medio condiciones operación transferencia O2 RO2 (mmol/lh) Tubo 10 ml agitación rotatoria 27 Erlen 500 ml 50 ml 200 rpm 40 300 rpm 48 100 ml 33 42 Erlen 1000 ml 40.8 Tanque agitado 12 l 500 rpm caudal aire 2 vvm 432

qo2 = demanda específica CONSUMO O DEMANDA DE OXÍGENO (rO2) La demanda o consumo de oxígeno varía con el tiempo La concentración de oxígeno disuelto (CL) depende de las velocidades de transferencia y consumo demanda ro2= qo2. X X = biomasa qo2 = demanda específica x = f (t) qO2 = f (t) El microorganismo mantiene un estado cuasi-estacionario ln X Tiempo CL rO2 - es proporcional al crecimiento qO2 depende de la concentración de oxigeno disuelto [O2], la edad del cultivo, fase de crecimiento (qO2 es máxima cuando  es máxima, es decir durante la fase exponencial) , tipo de cultivo, etc.

Demanda de Oxigeno: rO2 = dCL / dt = X. qO2 TRANSFERENCIA (RO2) - DEMANDA (rO2) Demanda de Oxigeno: rO2 = dCL / dt = X. qO2 Transferencia de Oxigeno: RO2 = dCL / dt = KLa (C* -CL) La transferencia debe ser mayor que la demanda para evitar limitación de oxigeno. Cómo aumentar la transferencia de oxígeno? 1- aumentando el KLa condiciones de operación (caudal de aire, agitación, etc) diseño del reactor (paletas, buffles) reología del cultivo 2- aumentando la fuerza impulsora aumentar C*

RO2= KL.a . (C* – CL) RO2= rO2 RO2=Kla(C*-Ccrit) RO2=Kla.C* CL ≥ Ccrit Relación entre demanda y transferencia de O2 Transferencia o suministro Consumo o demanda o x O s S Y r b q / max. . 2 µ = RO2= KL.a . (C* – CL) RO2= rO2 El microorganismo mantiene un estado cuasi-estacionario a mayor consumo, mayor transferencia Para que no exista limitación de oxígeno CL ≥ Ccrit Para la mayoría de los microorganismos Ccrit~ 5 - 10% C* RO2=Kla(C*-Ccrit) qo2 Ko2 + Co2L Co2L qo2max = Si RO2 < rO2 , se limita en O2 Si RO2 > rO2 , no se limita Si se limita CL ~ 0 RO2=Kla.C*

Cómo seleccionar el KLa para cubrir las necesidades del cultivo? Para que no exista limitación por O2 en ningún momento CLO2 > Ccrit en todo momento cultivo de levaduras Xf=10 g/l C*= 6 ml O2/l Qué KLa requiere? qO2=200 ml O2/gh El microorganismo mantiene un estado cuasi-estacionario transf. O2= consumo RO2= rO2 KLa(C*-C)=qO2X Se debe calcular el requerimiento de O2 cuando el consumo sea máximo X=Xmax qO2=qO2 max KLa (C*- C) = 200 mlO2/gh . 10 g/l Kla = 2000 mlO2/lh /(6-0.6)mlO2/l KLa= 400 h-1 10% C* Nos aseguramos que el suministro de O2 sea suficiente aún en la etapa de máx consumo

≠ ctes, = ctes y máx = ctes ≠ ctes ò xL tL Limitación por Oxígeno - µ t Y C a K x dx dt r o L O . * 1 / 2 + = ò xL Crecimiento lineal Crecimiento exponencial tL Kla . (C* - CL) = rO2 = qO2 máx.x µ qO2 qCO2 qs = ctes y máx rx rO2 rCO2 rS ≠ ctes RO2máx = Kla . C* = rO2 máx= qO2 .x µ qO2 qCO2 qs ≠ ctes, rx rO2 rCO2 rS = ctes

Método del sulfito para la determinación del KLa Es un método para determinar KLa en ausencia de microorganismos Se basa en que el Na2SO3 (0.015 M) en presencia de Cu++ o Co++ reacciona rápidamente con el O2 disuelto en el seno del líquido. Na2SO3 + O2 Na2SO4 (1) Cu++ o Co++ aprox. 0.5 – 2.10-3 M, pH 8 La velocidad de reacción (1) es rápida pero < que la velocidad de difusión del O2 En el film no hay reacción el O2 difunde a través de la película reacciona rápidamente con Na2SO3 Velocidad de consumo de O2 = velocidad de transferencia RO2= KLa C* CLO2=0

Que ocurre en cultivos con agregados celulares ? Si la unidad catalítica es una célula: Cultivos líquidos con bacterias no agregadas Vp Volumen celular No existe restricción en la transferencia L-S Gas Líquido 1 2 3 Célula Burbuja de aire G-L La principal resistencia a la transferencia de oxígeno es la película estanca G-L TRANSFERENCIA ES PROPORCIONAL AL KLa La unidad catalítica es un pellet o biofilm Vp > Volumen celular El oxígeno detectado en la interfase S-L dependerá del TAMAÑO del partícula El oxígeno disuelto en el INTERIOR dependerá de la resistencia interna de la partícula

Flóculos, agregados celulares, cultivos en biofilm Vp variable

Que ocurre en cultivos con agregados celulares ? Esquema del transporte G-L-S

Que ocurre en cultivos con agregados celulares ? Vp > Volumen celular Film estanco líquido alrededor de la partícula catalítica (interfase S-L) Concentración en el seno del líquido Perfiles de concentración de oxígeno dentro de la partícula cuando existe limitación difusional interna No hay restricción difusional ni externa ni interna Hay restricción difusional interna solamente 1 3 2 Perfil de concentración en el film líquido cuando hay resistencia difusional en la interfase

Características de los fenómenos de transporte en cultivos Los metabolitos y sustratos poliméricos y la formación de micelio pueden producir medios muy viscosos, generalmente no newtonianos, que limitan la transferencia de materia La formación de aglomerados celulares (flocs, pellets) y biofilms determina la existencia de restricciones difusionales externas e internas. Las últimas dan lugar a condiciones de anoxia, restricción severa de nutrientes, intoxicación por productos y lisis celular Las concentraciones de nutrientes y productos en los medios son normalmente bajos, por lo tanto los gradientes de concentración para la transferencia es limitada

Batch F1,C1 C2=C F2,C CÁLCULOS - Velocidades de transferencia VL C VG interfase G-L F1 C1 F2 Y2 VL C VG Y F2 C2 F1 Y1 F1,C1 F2,C Mezclado perfecto C2=C Ecuaciones de balance de materia – Fase líquida Fase gaseosa

Estado cuasiestacionario Balance para el Oxígeno Balance FL ) * ( . 2 1 L O G C a K V X F dt dX - = Balance FG Estado cuasiestacionario Transferencia=consumo F . X - F . X 1 1 O 2 2 O 2 2 = K a ( C * - C ) V L L L 2 . O L r V X F = - 1 1 2 2

Método del sulfito para la determinación del KLa rpm %O2 rO2 KLa Ln KLa ln rpm 300 400 500 500 + deterg 500 + antiesp Ln KLa Ln rpm

Estimación de KL - Parámetros adimensionales Los parámetros adimensionales del sistema de cultivo se agrupan en números adimensionales característicos Se pueden establecer correlaciones de Kl con los números adimensionales que describen la fluidodinamia Para una determinada característica de la partícula Vp, el factor determinante de KL es la fluidodinamia alrededor de la misma NUMEROS ADIMENSIONALES SHERGOOD- Estima la magnitud del transporte total de materia en relación a la difusividad REYNOLS – Refleja el régimen fluido dinámico alrededor de sólido. Asociado a turbulencia SCHMIDT - Refleja las propiedades del fluido