TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

¿QUÉ ES LA TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE? El término ADN recombinante hace referencia a la creación de nuevas combinaciones de segmentos o de moléculas de ADN que no se encuentran juntas de manera natural. La tecnología del ADN recombinante utiliza técnicas que provienen de la bioquímica de los ácidos nucleicos unidas a metodologías genéricas desarrolladas originalmente para la investigación de bacterias y de virus.

¿CUÁLES SON SUS APLICACIONES? Aplicaciones en investigación y medicina - Producción a gran escala de proteínas de utilidad médica - Animales transgénicos - Terapia génica Aplicaciones industriales Aplicaciones en agricultura - Mejora genética de los cultivos - Nuevos insecticidas naturales

2 FUNCIONES BÁSICAS ¿Y CÓMO SE HACE? CLONAR (OBTENER MULTIPLES COPIAS) UN GEN EXPRESAR UNA PROTEÍNA (CODIFICADA POR EL GEN DE INTERÉS) ¿Y CÓMO SE HACE?

2 ELEMENTOS ESENCIALES SECUENCIA DE ADN DE INTERÉS VECTOR

VECTORES Agentes que pueden insertar un fragmento de ADN dentro de una célula huésped = MOLÉCULA DE ADN TRANSPORTADORA Inserción de hasta 10kb Sistema más común 1. Plásmidos Filamentosos (M13, capacidad de inserción 10kb) Tipo I (T1, capacidad 23kb) Lamba (capacidad 25kb) P1 (capacidad 100 kb) 2. Fagos Capacidad de 44kb Plásmidos con sitios cos 3. Cósmidos Capacidad de 300kb Cromosoma artificial de bacterias 4. BAC

Células Huésped Levaduras Células mamíferas Bacterias Saccharomyces cereviseae, Pichia pastoris, etc. Levaduras Células mamíferas Bacterias Líneas celulares como CHO ( cél. Ovario Hamster) GRAM NEGATIVAS (E. coli, P.aeruginosa) GRAM POSITIVAS (Bacillus subtilis, S.aureus, Streptommyces)

1. Plásmidos Los plásmidos son moléculas de ADN de doble cadena circular covalentemente cerrado (ccc) extracromosómicas de origen natural que tienen un origen de replicación (ori+) y que se replican autónomamente en las células bacterianas. ¿Porqué son empleados como vectores? Porque son: Pequeños. Producen múltiples copias.

LOS PLÁSMIDOS SON ELEMENTOS DE TRANSFERENCIA DE INFORMACIÓN GENÉTICA ENTRE BACTERIAS

PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE CLONADO GEN LACZ (MARCADOR DE SELECCIÓN) GEN DE RESISTENCIA AL ANTIBIÓTICO (MARCADOR DE SELECCION) SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE ORIGEN DE REPLICACION

lacZ AmpR ADN foráneo

GEN LACZ SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE AMPR PLÁSMIDO DE CLONADO ORIGEN DE REPLICACIÓN

PRODUCTO DE PCR DIGESTIÓN DEL PLÁSMIDO Y DEL FRAGMENTO DE ADN CON LA MISMA ENZIMA DE RESTRICCION PLÁSMIDO DE CLONADO

DIGESTIÓN CON LA MISMA ENZIMA DE RESTRICCION PRODUCTO DE PCR EcoRI EcoRI EcoRI DIGESTIÓN CON LA MISMA ENZIMA DE RESTRICCION PLÁSMIDO DE CLONADO

PRODUCTO DE PCR DIGERIDO CON EcoRI PLÁSMIDO DE CLONADO DIGERIDO CON EcoRI DIGESTIÓN CON LA MISMA ENZIMA DE RESTRICCION

TUBO CON MEZCLA DE FRAGMENTO DE ADN Y PLÁSMIDO DIGERIDOS CON EcoRI LIGACIÓN ¿CON QUÉ? ADN LIGASA ADN LIGASA TUBO CON MEZCLA DE FRAGMENTO DE ADN Y PLÁSMIDO DIGERIDOS CON EcoRI

DOS RESULTADOS POSIBLES …. PLÁSMIDO NO RECOMBINANTE PLÁSMIDO RECOMBINANTE

TRANSFORMACIÓN BACTERIANA ¿CÓMO? MÉTODO QUÍMICO O FÍSICO

TUBO CON MEZCLA DE PLÁSMIDOS RECOMBINANTES Y NO RECOMBINANTES TUBO CON CULTIVO LÍQUIDO DE BACTERIAS

BACTERIA NO TRANSFORMADA DOS RESULTADOS POSIBLES …. BACTERIA TRANSFORMADA

SIEMBRA PLACAS CON MEDIO AGAR LB SUPLEMENTADO CON AMPICILINA, IPTG Y X-gal

INCUBACIÓN A 37°C POR 16 HORAS

A. TRES RESULTADOS POSIBLES …. BACTERIA NO TRANSFORMADA EN UN MEDIO CON AMPICILINA LA BACTERIA SIN PLÁSMIDO NO CRECE

B. TRES RESULTADOS POSIBLES …. BACTERIA TRANSFORMADA CON PLÁSMIDO NO RECOMBINANTE EN UN MEDIO CON IPTG Y Xgal EN UN MEDIO CON AMPICILINA LA BACTERIA CON PLÁSMIDO NO RECOMBINANTE (GEN LACZ INTEGRO) ES AZUL LA BACTERIA CON PLÁSMIDO CRECE

C. TRES RESULTADOS POSIBLES …. BACTERIA TRANSFORMADA CON PLÁSMIDO RECOMBINANTE EN UN MEDIO CON IPTG Y Xgal EN UN MEDIO CON AMPICILINA LA BACTERIA CON PLÁSMIDO NO RECOMBINANTE (GEN LACZ DISRUPTO) ES BLANCA LA BACTERIA CON PLÁSMIDO CRECE

PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE EXPRESIÓN PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN EN BACTERIAS COMPONENTES: ORIGEN DE REPLICACIÓN GEN DE RESISTENCIA AL ANTIBIÓTICO (para seleccionar las bacterias que contienen el plásmido; ej. ampicilina) SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE PROMOTOR (debe ser fuerte para tener una expresión elevada) SEÑAL DE TERMINACIÓN (finalización del ARNm) PARA LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA EN BACTERIAS PARA LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA EN CÉLULAS DE MAMÍFEROS 6. GEN REPORTERO 7. GEN DE RESISTENCIA AL ANTIBIÓTICO (para seleccionar las células que hayan incorporado el plásmido a su genoma; ej. neomicina)

PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE EXPRESIÓN

PLÁSMIDO DE EXPRESIÓN EN BACTERIAS

PLÁSMIDO DE EXPRESIÓN EN BACTERIAS: PROTEÍNAS DE FUSIÓN

¿SE PUEDEN EXPRESAR PROTEÍNAS HUMANAS O DE MAMÍFEROS EN BACTERIAS? Las células bacterianas son extremadamente útiles para la traducción activa de proteínas de mamíferos, immunológicamente activas. La expresión de genes de mamíferos en bacterias necesita resolver los problemas siguientes: 1. Las proteínas producidas por estos métodos no presentan modificaciones post-tranduccionales. 2. los promotores eucariotas no son reconocidos por las ARN polimerasas bacterianas. 3. los genes eucariotas contienen intrones. 4. los ARNm eucariotas no son todo el tiempo traducidos por los ribosomas bacterianos. 5. las proteínas presentes en grandes cantidades en las bacterias forman cuerpos de inclusión insolubles  6. las proteínas eucariotas pueden ser reconocidas como cuerpos extraños por las proteasas de la bacteria y ser degradadas.

EL CASO DE LA INSULINA HUMANA La productción de la insulina usADNo E. coli : El gen cromosómico de la insulina no puede ser utilizado para el clonado de la insulina en la bacteria, puesto que el codifica la pre-proinsulina que tiene una subdependencia de secuencias promotoras eucariotas y además contiene un intrón. Es por eso que hubo que primero crear un ADNc de la proinsulina (sin secuencia señal ni intrón) que pudiera ser unido a la extremidad 5' de éste ADNc con un codón metionina (ATG) sintetizado químicamente (en efecto, la AUG de la insulina se encuentra dentro de la secuencia señal). Este ADNc se inserta en un plásmido que tiene un fragmento del gen lacZ compuesto de un promotor y de una parte de la secuencia codante de la ß-galactosidasa, creando así una proteína de fusión.  Es éste plásmido recombinado el que es introducido en la E. coli. En la célula bacteriana, y bajo el control de secuencias de regulación del gen lacZ, de la ARNm es producido y traducido en proteínas constituídas una parte de ß-galactosidasa fusionada por la metionina suplementaria a la proinsulina. La insulina se obtiene tratando la proteína de fusión con bromuro de cianógeno, un reactivo que corta las uniones peptídicas junto a los residuos de metionina. La metionina no aparece en la secuencia de la proinsulina nativa. La insulina recombinada se repliega en una estructura tridimensional gracias a la formación de puentes disulfuro y el péptido C es cortado por proteasas dando lugar a la insulina humana pura. 

SELECCIÓN DEL PROMOTOR Según la célula huésped: - Bacteria - Célula eucariotas Según el tipo de ARN deseado en células eucariotas: - ARNm: ARN POLIMERASA tipo II -ARNsh: ARN POLIMERASA tipo III

PLÁSMIDOS DE EXPRESIÓN EN CÉLULAS DE MAMÍFEROS

PLÁSMIDOS DE EXPRESIÓN EN CÉLULAS DE MAMÍFEROS

MÉTODOS DE TRANSFECCIÓN

TRANSFECCION ESTABLE Y TRANSITORIA Se denomina trasfección transitoria aquella en la que el plásmido no ha sido integrado a uno de los cromosomas eucarióticos. Se habla de transfección estable cuando el plásmido se ha integrado a uno ó más cromosomas eucariotas. CO-TRANSFECCION La co-transfección es la transfección simultánea de varios plásmidos. Mediante la co-transfección se puede verificar si la transfección se ha realizado correctamente. Para lograrlo se co-transfecta un plásmido cuya presencia es verificada por una reacción rápida y simple que indica que el plásmido de interés ha sido bien transfectado.

GENES REPORTEROS O MARCADORES

GENES REPORTEROS O MARCADORES

GENES REPORTEROS O MARCADORES

2. FAGOS

¿ Qué son los virus ?

ESTRUCTURA DE LOS FAGOS FAGOS ICOSAEDRICOS FAGOS HELICOIDALES

CICLO LITICO VS. CICLO LISOGÉNICO

CLASIFICACION DE LOS FAGOS El genoma de los fagos puede ser: RNA simple cadena (MS2, Qß), RNA doble cadena (phi 6), DNA simple cadena (phi X174, fd, M13) o DNA doble cadena (T3, T7, lambda , T5, Mu, T2, T4). Los fagos pueden ser: -líticos, -temperados o lisogénicos

PARA PENSAR ….. LOS FAGOS UTILIZADOS COMO VECTORES ¿SON LÍTICOS O LISOGÉNICOS?

PLÁSMIDO FAGOS

3.Cósmidos

4. BAC BACTERIAL ARTIFICIAL CHROMOSOME