DNA Recombinante e Ingeniería Genética Clonación de DNA: Fundamentos Clonar significa hacer copias idénticas. Antes se aplicaba este término para el aislamiento y reproducción de una célula para crear una población de células idénticas para su estudio. La clonación de DNA se refiere a la separación de un gen específico o de un fragmento de DNA de un cromosoma mucho mayor y su unión a una pequeña molécula del DNA portador, para después replicar este DNA modificado miles o millones de veces, como consecuencia tanto del aumento del número de células como de la creación de múltiples copias del DNA donado en cada célula. El resultado es la amplificación selectiva de un gen o de un segmento de DNA dado. La donación de DNA de cualquier organismo incluye cinco procedimientos generales: Cortar el DNA en sitios precisos. Las endonudeasas específicas de secuencia (endonucleasas de restricción) hacen las veces de tijeras moleculares.

2. Unión covalente de dos fragmentos de DNA. La DNA ligasa la realiza. 3. Selección de una pequeña molécula de DNA capaz de autorreplicarse. Los segmentos de DNA que deben ser donados pueden unirse a plásmidos o aDNA víricos (vectores de clonación; un vector es un agente de entrega). Las moléculas de DNA compuestas de segmentos unidos covalentemente, procedentes de dos o más fuentes, se denominan DNA recombinantes. 4. Traslado del DNA del tubo de ensayo a una célula huésped que proporcionará la maquinaria enzimática necesaria para la replicación del DNA. 5. Selección o identificación de las células huésped con DNA recombinante. Los métodos utilizados para llevar a cabo estas tareas, y otras relacionadas, se denominan colectivamente tecnología del DNA recombinante o, más informalmente, ingeniería genética. En esta discusión inicial, nos centraremos en la donación de DNA en la bacteria Escherichia coli, que fue el primer organismo utilizado en el trabajo con DNA recombinante y que todavía es la célula huésped más común. E. coli tiene muchas ventajas: se conoce bastante bien el metabolismo de su DNA (y muchos otros procesos bioquímicos), muchos vectores de clonación que se encuentran asociados de manera natural con E. coli, como bacteriófagos y plásmidos, están bien caracterizados, y se dispone de técnicas efectivas para el traspaso de DNA de una bacteria a otra.

Las endonucleasas de restricción y la DNA ligasa producen DNA recombinante Un conjunto de enzimas, disponibles gracias a décadas de investigación sobre el metabolismo de los ácidos nucleicos, es de particular importancia para la tecnología del DNA recombinante. En la base de la metodología general para producir y propagar una molécula de DNA recombinante se encuentran dos tipos de enzimas (Fig. 1).

Fig. 1

Primero, las endonucleasas de restricción de tipo II cortan el DNA en secuencias específicas, generando una serie de fragmentos más pequeños. Segundo, el fragmento de DNA que debe ser clonado puede unirse a un vector de clonación adecuado mediante DNA ligasas, que empalman las moléculas de DNA.

El vector recombinante es introducido en una célula huésped, que amplifica el fragmento mientras experimenta muchas divisiones celulares. Las endonucleasas de restricción se encuentran en muchas especies bacterianas. Werner Arber descubrió que su función biológica es reconocer y cortar DNA foráneo (p. ej., el DNA de un virus infeccioso); se dice que este DNA está restringido. La secuencia que sería reconocida por la endonucleasa de restricción en el DNA de la propia célula huésped está protegida de la digestión por la metilación del DNA, catalizada por una DNA metilasa específica. El conjunto formado por la endonucleasa de restricción y la metilasa correspondiente se conoce como sistema de restricción-modificación. Existen tres tipos de endonucleasas de restricción, designados como I, II, Y III. Los tipos Iy III son grandes complejos formados por múltiples subunidades que contienen, simultáneamente, las actividades endonucleasa y metilasa. Las endonucleasas de restricción de tipo Icortan el DNA al azar, en lugares que pueden estar a 1.000 pares de bases o más de la secuencia de reconocimiento. Las endonucleasas de restricción de tipo III cortan el DNA a unos 25 pares de bases de la secuencia de reconocimiento. Ambos tipos de enzimas se mueven a lo largo del DNA mediante un mecanismo que necesita la energía del ATP. Las enzimas de tipo II, aisladas por primera vez por Hamilton Smith, son más sencillas, no necesitan ATP y cortan el DNA en la misma secuencia de reconocimiento.

La extraordinaria utilidad de estas enzimas fue demostrada por Daniel Nathans, que las usó por vez primera para desarrollar nuevos métodos para obtener mapas y analizar genes y genomas. Se han descubierto millares de endonucleasas de restricción en diferentes especies bacterianas. Alrededor de unas 100 secuencias de DNA diferentes son reconocidas por uno o más de estas enzimas. Las secuencias reconocidas tienen normalmente de cuatro a seis pares de bases y son palindrómicas.

Palíndromos y repeticiones especulares Los palíndromos son secuencias de los ácidos nucleicos de doble cadena que poseen un eje binario de simetría. Para superponer una repetición (secuencia sombreada) sobre la otra debe producirse una rotación de 180 º alrededor del eje horizontal, y posteriormente otra alrededor del eje vertical, como muestran las flechas coloreadas. Por su parte, una repetición especular presenta una secuencia simétrica en cada hebra. La superposición de una repetición sobre la otra implica una única rotación alrededor del eje vertical. En unos pocos casos, la interacción entre la endonucleasa de restricción y su secuencia diana ha podido determinarse con gran detalle a nivel molecular. Algunas endonucleasas de restricción realizan cortes indentados en las dos hebras del DNA, que dejan de dos a cuatro nucleótidos desapareados en cada extremo. Se los conoce como extremos cohesivos (Fig. 2a), debido a que pueden aparearse entre sí o con extremos cohesivos complementarios de otros fragmentos de DNA. Otras endonucleasas de restricción cortan ambas cadenas del DNA en los enlaces fosfodiéster opuestos, de modo que no dejan bases desapareadas en ningún extremo; estos extremos se denominan extremos romos (Fig. 2b).

Fig. 2

El tamaño medio de los fragmentos producidos al cortar DNA genómico con una determinada endonucleasa de restricción depende de la frecuencia con que se encuentre su sitio de restricción en la molécula de DNA, que, a su vez, depende en buena medida del tamaño de la secuencia de reconocimiento. En una molécula de DNA de secuencia al azar, en la que todos los nucleótidos sean igualmente abundantes, una secuencia de 6 pares de bases reconocida por una endonucleasa de restricción tal como BamHI se dará como promedio una vez cada 46 (4.096) pares de bases. Las enzimas que reconocen una secuencia de 4 pares de bases producirán fragmentos de DNA más pequeños en una molécula de DNA de secuencia al azar; una secuencia de este tamaño debería encontrarse, como promedio, una vez cada 44 (256) pares de bases. Las secuencias de reconocimiento suelen ocurrir con menor frecuencia de lo esperado según estos cálculos, porque las secuencias de nucleótidos en el DNA no son al azar y los cuatro nucleótidos no son igualmente abundantes. El tamaño medio de los fragmentos producidos por ruptura de una gran moléculas de DNA por endonucleasas de restricción se puede aumentar, simplemente terminando la reacción antes de que se haya completado. Este procedimiento se denomina digestión parcial. Una vez una molécula de DNA se ha cortado en fragmentos de DNA, un fragmento determinado de tamaño conocido puede ser enriquecido mediante electroforesis en gel de agarosa o de acrilamida o por HPLC .

Debido a que la ruptura de un genoma típico de mamífero por una endonucleasa de restricción origina demasiados fragmentos, el aislamiento de un determinado fragmento de DNA por electroforesis o HPLC es poco práctico. Un paso intermedio en la clonación de un gen específico o de un fragmento de DNA es, a menudo, la construcción de una genoteca de DNA. Un fragmento de DNA aislado se une con un vector de clonación, digerido de forma similar, utilizando DNA ligasa. El apareamiento de los extremos cohesivos complementarios facilita mucho la reacción de ligación (Fig. 2a). Un fragmento generado por digestión con EcoRI generalmente no se unirá a un fragmento generado por BamHI. Los extremos romos también se pueden ligar, aunque con menor eficiencia. Se pueden crear nuevas secuencias de DNA insertando fragmentos de DNA sintéticos (conectores) entre los extremos que van a ser ligados (Fig. 2c).

Fig. 2 c

Los fragmentos de DNA que contienen secuencias múltiples de reconocimiento para endonucleasas de restricción (a menudo son útiles como puntos de inserción de otros DNA por corte y ligación) se denominan policonectores. La eficacia de los extremos cohesivos para la unión selectiva de dos fragmentos de DNA se puso de manifiesto en los primeros experimentos con DNA recombinante. Antes de que las endonucleasas de restricción fuesen ampliamente disponibles, algunos investigadores encontraron que era posible generar extremos cohesivos por la acción combinada de la exonucleasa del bacteriofago A y la transferasa terminal. Mediante este procedimiento, los fragmentos de DNA que debían unirse adquirían colas homopoliméricas complementarias (Fig. 3).

Fig. 3

Para formar extremos cohesivos se añaden colas homopoliméricas complementarias a los extremos de los dos fragmentos que deben unirse. Después de la hibridación, se rellenan los huecos y se sellan las mellas por la acción consecutiva de la DNA polimerasa I y de la DNA ligasa. Este método fue utilizado por Peter Lobban y Dale Kaiser en 1971 en los primeros experimentos de unión de fragmentos de DNA naturales. Poco después, en el laboratorio de Paul Berg se utilizaron métodos similares para unir segmentos de DNA del virus 40 de simio (SV40) con DNA procedente del bacteriófago A, generándose así la primera molécula de DNA recombinante que contenía fragmentos de DNA de especies diferentes.

(b) El sustrato óptimo de la transferasa terminal es el 3´OH en el extremo de una cadena simple de DNA de al menos tres nucleótidos. Si los extremos del dúplex de DNA tienen un extremo 5´protuberante de cadena sencilla ó son extremos romos, la exonucleasa del bacteriófago lambda (que degrada las cadenas de DNA en sentido 5´ 3´puede crear un buen sustrato para la transferasa terminal. N indica base.

Bibliografía Nelson David L, Cox Michael M. “ Lehninger Principios de Bioquímica”. Ediciones Omega. 2001