TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE. CAPITULO 15 TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE. Manipulación del DNA ENZIMAS DE RESTRICCION / MAPAS DE RESTRICCION VECTORES DE CLONACION - TIPOS GENOTECAS - TIPOS CLONACION IDENTIF. DE SECUENCIAS CLONADAS METODOS PARA EL ANALISIS DE SECUENCIAS: SOUTHERN/ NORTHEN/WESTERN PCR SECUENCIACION

BIBLIOGRAFIA Griffiths et al. (2000) Klug y Cummings (1999) Tamarin (1999) Strachan et al. (1996) Kaplan et al. (1993) wwwhttp://www.cbs.dtu.dk/dave/roanoke/genetics.html

ENZIMAS DE RESTRICCION * Nucleasa sintetizada por las bacterias como un mecanismo de defensa natural * Nucleasa capaz de reconocer y cortar una secuencia específica de nucleótidos en una doble cadena * Longitud de la secuencia reconocida de 4 a 8 bp * Reconocen secuencias palindrómicas Primera enzima descubierta fue a partir de Haemophilus influenzae

EXTREMOS COEXIVOS

EXTREMOS ROMOS

Mapas de restricción

Mapas de restricción

VECTORES DE CLONACION . REPLICACION AUTONOMA . MAPA DE RESTRICCION CONOCIDO Un único pto. De corte . MARCADORES SELECTIVOS Resistencia antibióticos Cambios de color . RECUPERACION SENCILLA . TIPOS: Plásmidos, fagos, cósmidos, YACs, BACs, etc.

BACs Polilinker Resistencia antibióticos Factor F de Bacterias: plásmido con replicación autónoma, que transfiere información genética durante la conjugación bacteriana Polilinker Resistencia antibióticos

CLONACION 1º Inserción del fragmento de DNA a clonar en un Vector de clonación: MOLECULA DE DNA RECOMBINANTE

CLONACION 2º Introducción mol. DNA recombinante en hospedador (bacterias) 3º Vectores se multiplican de forma autónoma 4º Bacteria se divide 5º Un gran nº de copias dará lugar a un clon, con muchas copias del fragmento

GENOTECA . Clonación de todas las secuencias del genoma . Presente al menos una copia de cada gen . Nº de clones depende: - tamaño inserto - tamaño genoma . Tipos : genómicas, cromosómicas, cDNA ln ( 1-p) N : nº de clones N = -------- P : Prob de recuperar ln ( 1-f) f: fracción genoma en el clon

ln ( 1-f) f: fracción genoma en el clon ln ( 1-p) N : nº de clones N = -------- P : Prob de recuperar ln ( 1-f) f: fracción genoma en el clon Genoma humano: 3,0 x 106 Kb P : 99% f : Inserto 17 Kb - 1,7 x 104 /3 x 109 N : 8.1 x 105 fagos Genoma humano: 3,0 x 106 Kb P : 99% f : Inserto 5 Kb N : varios millones plásmidos Genoma humano: 3,0 x 106 Kb P : 99% f : Inserto 50 Kb N : 400.000 cósmidos

1º PASO SOUTHERN BLOTTING 3º PASO 2º PASO 4º PASO 5º PASO

1º PASO: DESNATURALIZACION

2º PASO: ANILLAMIENTO DE PRIMERS

3º PASO: ELONGACION

Método de Maxan y Gilbert SECUENCIACION Método de Maxan y Gilbert

Método de Maxan y Gilbert SECUENCIACION Método de Maxan y Gilbert

METODO DE SANGER 1º Paso: Desnaturalización 2º Paso: Adición de : dNTPs DNApolimerasa cebador 3ºPaso: adición de ddNTPs