Degradación aeróbica de tolueno: el plásmido TOL

Representative hydrocarbons in petroleum Alkanes n-alkane Ramified alkane Ciclics Ciclopentane Ciclooctane Biciclooctan Ciclohexane Bicicloheptane Aromatics Benzene Naphtalene Fenantrene Benzo (a) pirene

Hidrocarburos aromático: Representativos de contaminación (petróleo e industria) Estructuras muy estables Contaminantes antropogénicos Estructuras diseñadas para ser muy estables (Diseñadas para ser tóxicas) DIFÍCILES DE DEGRADAR

COMPUESTOS CONTAMINANTES DE ORIGEN INDUSTRIAL Orgánicos Pesticidas (concentraciones traza pero MUY tóxicos) Compuestos aromáticos policíclicos Hidrocarburos policlorados, solventes orgánicos y carburantes (BTEX) Solventes orgánicos NO clorados Tintes, detergentes, ... Inorgánicos Fosfatos y nitratos (agricultura intensiva) Metales tóxicos (Zn, Cd, Ni, Cu, Pb, Cr, Hg, Mo, As, Se)

ORGANISMOS IMPLICADOS EN LA RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS MICROORGANISMOS Bacterias Muy versátiles Buen nivel de conocimiento Fáciles de manipular Hongos Versátiles Bajo nivel de conocimiento de cepas silvestres Difíciles de manipular PLANTAS Gran tamaño (visibles) Manipulables INVERTEBRADOS Como reactores (futuro?)

Manipulación requiere CONOCIMIENTO PREVIO • Organismos y sus posibilidades • Rutas disponibles • Regulación de la rutas • Mecanismos disponibles para su manipulación ¿Qué conocimiento tenemos? ¿Cómo llegamos esta información?

C H t o l u e n 3 Compuesto natural Origen antropogénico constituyente del petróleo (BTX) Origen antropogénico t o l u e n Clasificado como contaminante prioritario por la EPA Ejemplo mejor estudiado Compuesto modelo Conocimiento profundo a nivel bioquímico, genético, fisiológico, manipulación de rutas, circuitos reguladores, evolución, etc...

Bioquímica de la degradación aeróbica de tolueno CH3 tolueno Bioquímica de la degradación aeróbica de tolueno Plásmido TOL Pseudomonas putida mt-2 Aislada en los años 60 Microbiología 1900 1930 Microorganismos capaces de crecer a expensas de compuestos aromáticos "Ecología microbiana" 1960 1as evidencias de una nueva ruta: rotura en meta Bioquímica 1940 1950 Oxidación de la cadena lateral del tolueno Oxidación del benceno vía catecol Estudios exhaustivos de degradación de alquilaromáticos Aislamiento e identificación de intermediarios

Pseudomonas putida mt-2 Dos rutas diferentes para la degradación de benzoato: Rotura en orto (puede degradar BENZOATO) Rotura en meta (puede degradar METIL-BENZOATOS) C O H C O H CH3 Aparecen mutantes espontáneos que parecen cambiar su metabolismo de tipo meta a tipo orto. ben+, m-ben- Han perdido TODAS las enzimas de la ruta meta. Son MUY estables (no hay revertientes). Mismo fenotipo se obtiene curando con Mitomicina C El carácter el TRANSMISIBLE Los genes de la ruta meta presentes en un plásmido: TOL (pWW0)

Métodos para el estudio de rutas • Detección e identificación de compuestos intermediarios (resting cells) • Estudios isotópicos • Estudios de adaptación simultánea • Obtención y análisis de mutantes

TOL TOD TOM TBU T4MO P. putida mt-2 P. putida F1 B. cepacia G4 R. pickettii PK01 T4MO P. mendocina KR1

Intermediarios centrales X I D A C Ó N d e l a n i o R U P T G E L Í AEROBIOSIS CH3 O H C 2 Activación del anillo Apertura del anillo Oxidación Reacciones periféticas O H C p r o t c a e u g n i s Intermediarios centrales catecol

C A T E C O L H O C H C O O H C H C H C H N H N C O O H H C O C O O H 3 2 C H N H 2 N C O O H H a n t r a c e n o L - m a n d e l a t o t o l u e n o L - t r i p t ó f a n o f e n a n t r e n o C O C O O H C H O H C O C H C H N H 2 2 2 C O O H C O O H N H C H O O H f o r m i l q u i n u r e n i n a a l c o h o l n a f t a l e n o b e n z o i l f o r m i a t o C H O b e n c í l i c o s a l i c i l a t o C O C H C H N H C H C H C O O H b e n z a l d e h í d o 2 2 C O O H N H 2 C O O H C O O H q u i n u r e n i n a c i n a m a t o b e n c e n o N H 2 N H O H 2 b e n z o a t o a n t r a n i l a t o a n i l i n a f e n o l O H O H C A T E C O L

Cis-benzoato dihidrodiol P. putida mt-2 Ruta TOL CH2OH Alcohol bencílico CHO benzaldehído COOH benzoato CH3 XO DH DH tolueno CH3 xyleno T1,2DO HOOC H OH Cis-benzoato dihidrodiol catecol DHDH Rotura en posición meta

cis-toluene dihydrodiol X F C1 C2 B A T S I G E D H CH 3 toluene ISPTOL O2 FerredoxinTOL ReductaseTOL NAD+ (todC1C2) (todB) (todA) ISPTOL FerredoxinTOL ReductaseTOL NADH+H+ CH 3 H OH OH H cis-toluene dihydrodiol NAD+ (todD) NADH+H+ CH 3 OH OH 3-Methylcatechol O2 (todE) Ring fission

No todos los sustituyentes están permitidos Orto Meta

Rotura del anillo: DIOXIGENASAS OH OH C A T E O L meta orto 2,3 Dioxigenasa 1,2 Dioxigenasa C O H C O H cis,cis-muconato Semiladhido hidroximucónico

M E T A Catecol 2,3 Dioxiganasa O H O H O H O H C H O O O H O H C O O - m e t i l c a t e c o l O 2 Catecol 2,3 Dioxiganasa O 2 O H O H C O O H C O O H C H O C H 3 O H C O O H C O s e m i a l d e h í d o 2 - h i d r o x i m u c ó n i c o C H 3 2 - h i d r o x i , 6 - o x o s e m i a l d e h i d o s e m i a l d e h i d o 2 , 4 - h e p t a d i e n o a t o 2 - h i d r o x i m u c o n a t o 2 - h i d r o x i m u c o n a t o d e s h i d r o g e n a s a 2 - h i d r o x i , 6 - o x o h i d r o l a s a O 2 , 4 - h e p t a d i e n o a t o h i d r o l a s a C O O H O H 2 - o x o 4 - p e n t e n o a t o C O O H C O 2 C O O H 2 - h i d r o x i - 2 , 4 - p e n t a d i e n o a t o h i d r a t a s a 4 - o x a l c r o t o n a t o ( e n o l ) H O O 4 - o x a l c r o t o n a t o i s o m e r a s a C O O H 4 - o x a l c r o t o n a t o 4 - h i d r o x i - 2 - o x o v a l e r a t o d e s c a r b o x i l a s a O 4 - h i d r o x i - 2 - o x o v a l e r a t o a l d o l a s a C O O H + C O O H C H C H O C H C O C O O H 3 3 4 - o x a l c r o t o n a t o ( c e t o ) a c e t a l d e h í d o p i r u v a t o a c e t a l d e h í d o d e s h i d r o g e n a s a O C H C S C o A 3 a c e t i l C o A

O R T O O H H O O C O H O H O H O c a t e c o l 1 , 2 - d i o x i g e p r o t o c a t e c u a t o O c a t e c o l 1 , 2 - d i o x i g e n a s a p r o t o c a t e c u a t o O 2 2 3 , 4 - d i o x i g e n a s a H O O C C O O H C O O H C O O H C O O H c i s , c i s - m u c o n a t o b - c a r b o x i - c i s , c i s - m u c o n a t o m u c o n a t o l a c t o n a s a b - c a r b o x i m u c o n a t l a c t o n a s a H O O C C O O H C O O H O O O O m u c o n o l a c t o n a g - c a r b o x i m u c o n o l a c t o n a C O O H O m u c o n o l a c t o n a g - c a r b o x i m u n l t d e s i s o m e r a s a O b - c e t o a d i p a t o e n o l l a c t o n a b - c e t o a d i p a t o e n o l l a c t o n a h i d r o l a s a O C O O H C O O H b - c e t o a d i p a t o b - c e t o a d i p a t o s u c c i n i l C o A t r a n s f e r a s a O C O S C o A C O O H b - c e t o a d i p i l C o A b - c e t o a d i p i l C o A t i o l a s a O O C S C o A H O O C H C C S C o A 3 s u c c i n i l C o A a c e t i l C o A

OXIGENASAS Dioxigenasas CH3 Monoxigenasas CH3  del anillo  Tolueno dioxigenasa  Benzoato dioxigenasa  (Metil)benzoato dioxigenasa (“toluate dioxygenase”)  abren el anillo CH3  Catecol 1,2-dioxigenasa  Catecol 2,3-dioxigenasa  Protocatecuato 3,4-dioxigenasa Monoxigenasas  del anillo  Tolueno 2-monooxigenasa  Tolueno 3-monooxigenasa  Fenol hidroxilasa  Tolueno 4-monooxigenasa CH3  4-hidroxibenzoato 3-hidroxilasa  de la cadena lateral  Xileno monooxigenasa

Flavoproteína reductasa sulfoférrica Dioxigenasas del anillo Flavoproteína reductasa sulfoférrica C H 3 NAD+ FAD o FMN Flavoproteína reductasa [2Fe-2S] Ferredoxina Rieske [2Fe-2S] Fe++ Oxigenasa Compuesto aromático O2 + 2 H+ NADH+H+ C H 3 H O O C H O H H O H O H H Derivado dihidroxilado

Transporte de electrones Dioxigenasas del anillo Clase Transporte de electrones Oxigenasa Ejemplo 4-sulfobenzoato FMN 3,4-dioxigenasa [2Fe-2S] 4-clorofenilacetato IA FMN 3,4-dioxigenasa [2Fe-2S] FMN ftalato 4,5-dioxigenasa [2Fe-2S] FAD 2-oxo-1,2-dihidroquinolina 8-monoxigenasa [2Fe-2S] IB FAD benzoato 1,2-dioxigenasa [2Fe-2S] dibenzofurano IIA FAD 4,4a-dioxigenasa benceno IIB FAD 1,2 dioxigenasa R III FAD naftaleno 1,2 dioxigenasa [2Fe-2S] R Reductasa Ferredoxina ISP ISP [2Fe-2S (mononuclear]

A resaltar: Es una limitación, pero  es manipulable. Generalmente varias subunidades Cadena más o menos compleja de transporte de electrones. La reacción que llevan a cabo es similar. Especificidad de sustrato Sustratos metabolizados por la ruta TOL: tolueno, m-xyleno, p-xyleno, 3-etiltolueno, 1,2,4 trimetilbenzeno, ... Es una limitación, pero  es manipulable. “Rasgos” que identifican una ruta: Modo de activación del anillo Modo de rotura del anillo

Protocatecuato 3,4-dioxigenasa (abFe3+)12 P. putida Ohlendorf et al., 1988

Protocatecuato 3,4-dioxigenasa (abFe3+)12 P. putida Orville et al., 1997

Catecol 2,3-dioxigenasa (aFe++)4 P. putida mt-2 Kita et al., 1999

Catecol 1,2-dioxigenasa (aFe3+)2 Acinetobacter sp. ADP1 4-metilcatecol Vetting & Ohlendorf, 1999

Degradación anaeróbica de tolueno

Introducción Catabolismo de hidrocarburos aromáticos se consideraba EXTRICTAMENTE dependiente de O2. En las rutas descritas, el ataque inicial del anillo requiere SIEMPRE O2 molecular (Mono- y Dioxigenasas). Últimos 10 años: algunos organismos TAMBIÉN puede degradar Hidrocarburos en ANAEROBIOSIS. Procesos anaerobios están empezando a mostrar un gran POTENCIAL para la solución de problemas de contaminación ambiental.

Historia Observación: aromáticos NO se acumulan en la naturaleza en zonas anaerobias. 1985-86 El tolueno es degradado en sedimentos contaminados con hidrocarburos. 1990 Se consiguen los primeros cultivos puros. Tanto de zonas contaminadas como pristinas Están taxonómicamente relacionados

Aerobio vs anaerobio Aerobios: Oxígeno cumple dos funciones: - Aceptor de electrones (RESPIRACIÓN) - Sustrato de las dioxigenasas Anaerobios: - Oxígeno puede sustituirse por OTROS ACEPTORES - La reactividad del O2 en Oxigenasas es INSUSTITUIBLE Estos organismos deben de haber desarrollado rutas diferentes, novedosas, independientes del oxígeno.

reducción de diferentes aceptores de electrones. Reacciones estequiométricas de oxidación anaeróbica de tolueno acopladas a la reducción de diferentes aceptores de electrones. Bacterias desnitrificantes : C7H8 + 7.2 NO3- + 0.2 H+ 7 HCO3- + 3.6 N2 + 0.6 H2O Gº’ = - 3554 kJ (mol tolueno)-1 Bacterias reductoras de hierro (III) : C7H8 + 94 Fe(OH)3 7 FeCO3 + 29 Fe3O4 + 145 H2O Gº’ = -3398 kJ (mol tolueno)-1 • Bacterias sulfatoreductoras : C7H8 + 4.5 SO4= + 3 H2O 7 HCO-3 + 2.5 H+ +4.5 HS- Gº’ = -205 kJ (mol tolueno)-1

Cepas bacterianas disponibles en cultivo puro e identificadas Bacterias desnitrificantes (subclase  de proteobacterias) Thauera aromatica K172 Thauera aromatica T1 Azoarcus sp. Cepa T. Azoarcus tolulyticus Tol4 Azoarcus tolulyticus Td15 Bacterias reductoras de hierro (subclase  de proteobacterias) Geobacter metallireducens GS15 Bacterias sulfatoreductoras (subclase  de proteobacterias) Desulfobacula toluolica Tol2 Desulfobacterium cetonicum

Elucidación de la ruta La activación del sustrato (tolueno) y la rotura en ausencia de O2 es similar en todas las cepas anerobias, independientemente del aceptor de electrones que utilice. ¿Cómo se activa el anillo? ¿Cómo es la apertura del anillo? Microbiología/ecología de anaerobios.

Métodos Estudios isotópicos (compuestos marcados con 13C o 14C). Detección e identificación de intermediarios Inhibodores metabólicos Análogos del tolueno Bajas temperaturas Limitación en aceptores de electrones Adaptación simultánea Análisis de mutantes En muchos cultivos, se observa acumulación transitoria de BENZOATO y/o BENZOIL-CoA C O H S C o A O CONFIRMACIÓN: aparece benzoil-CoA en Estudios in vitro con extractos crudos libres de células. Estudios in vivo con sustratos marcados

Se identifica BENCIL-SUCCINATO H b e n c i l s u a t o Este compuesto se había considerado inicialmente un producto terminal no metabolizable (dead-end) Se propone el primer paso de la reacción: ADICIÓN DE FUMARATO C H 3 t o l u e n O b c i s a f m r Estudios cinéticos in vivo/in vitro apoyan la propuesta Se identifica la bencilsuccinato sintetasa

Thauera aromatica K172 C H S o A O B : g No requiere ATP 3 S o A O b e n z i l t u 2 [ ] c s a f m r E - x h d p B : g No requiere ATP Se detecta E-fenilitaconilCoA Velocidad aumenta en presencia de succinilCoA como fuente de CoA Se detecta actividad SuccinilCoA:bencilsuccinato CoA-transferasa

Anillo activado (benzoilCoA) No se han detectado ni todos los intermediarios ni todas las reacciones. Pero cada vez hay más datos que apoyan esta ruta. Comprobado en detalle en Thauera y Azoarcus (desnitrificantes) Algunas de las reacciones se han identificados en bacterias sulforreductoras (muy distintas filogenéticamente). Mecanismo común a todas las cepas (?) Anillo activado (benzoilCoA) Rotura: en todos los casos, reacción hidrolítica. Es necesaria una reducción previa del anillo: BenzoilCoA Reductasa (requiere ATP; es MUY específica) Sigue -oxidación Las reacciones hasta la rotura del anillo están DEMOSTRADAS en Thauera y en Rhodopseudomonas

C O H S o A 6 - h i d r o x i 1 - c i c l o h e x e n o B e n z o i l 3 2 [ ] 1 , 5 - c i l h e x a d n r b 6 t p m 6 - h i d r o x i 1 - c i c l o h e x e n o B e n z o i l C o A r e d u c t a s a C o A h i d r a t a s a 1 - c a r b o x i l C o A d e s h i d r o g e n a s a O S C o A O S C o A O S C o A O S C o A C 2 A T P 2 [ A D P + P ] C H O C C i 2 N A D + N A D H + H + O b e n z o i l C o A 2 [ H ] 6 - c e t o 1 - c i c l o h e x e n o C O H S o A Rhodopseudomonas palustris PimelilCoA 2 H O 2 1 - c a r b o x i l C o A h i d r o l a s a C O H S o A 2 a c e t i l C o A 3 - h i d r o x i p i m e l i l C o A d e s h i d r o g e n a s a O S C o A O S C o A O S C o A C C O S C o A C O C O O H C O O H C O O H

Muy sensible a O2 (V = 20 s) Bencilsuccinato sintetasa a2b2g2 aa’b2g2 Activador (¿ORF?)

Especificida de sustrato BenzoilCoA reductasa Especificida de sustrato 2[4Fe-4S] Ferredoxina Fe/S FAD Benzoil CoA reductasa Donador de electrones? abgd

C o - s u s t r a t o s a n a e r o b i o s : 2 [ H ] , C O , A T P , m e d i o s S C o A O H c e n t r a l e s ( a n a e r o b i o s ) b e n z o i l - C o A O 2 [ H ] 2 A N A E R O B I O S I S 2 A T P O H O S C o A O H r e s o r c i n o l R E D U C C I Ó N d e l a n i l l o R U P T U R A H I D R O L Í T I C A O H C o A S H C O H H O O H f l u o r o g l u c i n o l O H I n t e r m e d i o s O O H c e n t r a l e s 2 c a t e c o l ( a e r o b i o s ) O H O X I D A C I Ó N d e l a n i l l o C O O H R U P T U R A O X I G E N O L Í T I C A O H O O H A E R O B I O S I S 2 O H p r o t o c a t e c u a t o C O O H C O O H C O O H H O C o - s u s t r a t o s a e r o b i o s : O , H O O H 2 2 g e n t i s a t o

O H C N 2 A T E L 3 a n i l t r c e o s f b z d h í - m u p ó q

B E N Z O I L C o A C O O H C H C O O H C O O H C H O H C H N H C H C 3 2 C H N H 2 C H C H C O O H O C H O H 3 C H 2 O H O H O H O H O C H H N C H C O O H 3 2 v a i n i l l a t o p - c r e s o l p r o t o c a t e c u a t o f e n o l a l c o h o l N C H 2 O H p - m e t o x i b e n c í l i c o H c u m a r a t o t r i p t ó f a n o C O O H f e n i l a l a n i n a N H C O O H 2 N H 2 C O O H C H O H H N C H C O O H 2 a n i l i n a 2 C H 2 2 - a m i n o b e n z o a t o C O O H C l O H 3 - c l o r o b e n z o a t o a l c o h o l C O p - h i d r o x i b e n z o a t o b e n c í l i c o O S C o A C O H t i r o s i n a f e n i l - o x o a c e t a t o O S C o A O S C o A C C C O H b e n z o a t N H N H 2 2 t o l u e n C H 3 o - a m i n o b e n z o i l C o A O H p - h i d r o x i b e n z o i l C o A O S C o A C B E N Z O I L C o A

Características generales de cepas anaerobias que degradan tolueno Tanto estrictas como facultativas. Espectro de hidrocarburos aromáticos que son capaces de degradar es MUY REDUCIDO. tg generalmente mayor que en aerobios. (desnitrificantes son las que tienen velocidad de crecimiento mayor) Muchas formas de respiración.

Identificación de GENES Mutagénesis al azar - química - transposones  SELECCIÓN de clones inactivos secuenciación (cromosoma) Genoteca - Complementación - Búsqueda de actividades Confirmación - producto génico - Comparación con proteína conocida Análisis de secuencia

Aplicaciones Gran potencial para la solución de problemas de contaminación medioambiental. Zonas contaminadas con frecuencia son ANAEROBIAS. OXIGENACIÓN  $$ TRANSPORTE  no es considerable en áreas grandes. Considerar recuperación in situ basada en organismos ANAEROBIOS. Adición de otros aceptores de electrones, más solubles (fácil y barato). Degradación lenta Aplicable cuando la contaminación sólo afecta al suelo (no hay acuífero amenazado).

Estimaciones energéticas potenciales Oxígeno disuelto en agua saturada: 8,6 mg/l Esto permitiría oxidar 2,8 mg tolueno/l Concentración saturante de sulfato en agua: 2 g/l Esto permitiría oxidar (anaeróbicamente) 300 mg tolueno/l Pero Procesos aerobios son mucho más RÁPIDOS. Organismos aerobios son más versátiles.

Acuíferos aeróbico Accidente! O2 contaminante O2 NR MnR contaminante Zona no saturada Accidente! O2 contaminante O2 NR MnR contaminante contaminante NR MnR O2 Tiempo FeR SR

SO4= NO3- contaminante M O2 NR SR FeR S= N2 Zona no saturada H2O CO2 CH4 Fe(III) Fe(II) S= H2O N2 Zona no saturada

Organización genética y regulación

Regulación + Ausencia de sustrato Presencia de sustrato ARN-Polimerasa ADN Gen Ausencia de sustrato Regulador ADN Gen Presencia de sustrato ARN-Polimerasa Regulador + ARN Proteínas

Genes Reguladores ARN-Polimerasa Gen ADN ARN Ribosomas Proteínas Operón Proteínas

C C C Activación de un regulador A Regulador XylR Reprimido Deleción A ADP + Pi ADP + Pi C ATP ATP Activado por el efector (desreprimido) Constitutivo O‘Neill & al., 1998

• Clonación de la ruta a partir del plásmido TOL aislado (genoteca) pWW0 P. putida mt-2 • Clonación de la ruta a partir del plásmido TOL aislado (genoteca) • Mutagénesis al azar • Mapeo y localización de los mutantes (secuenciación) • Análisis bioquímico: identificación de gen-función U W C M A B N xyl Operón upper X Y Z L T E F G J Q K H I S R Operón meta Organización genética

pWW0 Tra/Rep C L H J K B R F M A T J C O tnpA I (Tn4653 ) G N S X tnpT tnpS G 117 kb B H res E xylR H tnpA I Operón xylS (Tn4561 ) F upper V Operón D F meta Q G E D D J XhoI A C E EcoRI P HindIII A Tn4653 Tn4651

Regulación de la expresión Determinar actividades en células creciendo en distintos medios: No-sustrato de la ruta (acetato) Sustratos de la ruta upper Sustratos de la ruta meta Sustrato de crecimiento TO BADH C2,3DO HMSD Acetato - - - - Tolueno + + + + Bencilalcohol + + + + Benzoato - - + + 3-metilbenzoato - - + + Acetato + Tolueno + + + +

TODAS las actividades son inducibles Sustratos de la ruta meta sólo inducen a la ruta meta Sustratos de la ruta upper inducen tanto a la ruta upper como a la ruta meta Mutante PaW210: Sustrato de crecimiento TO BADH C2,3DO HMSD Acetato - - - - Tolueno - - - - Bencilalcohol - - - - Benzoato - - + + 3-metilbenzoato - - + + Ruta upper NO es inducible Ruta meta SÓLO es inducible por sustratos de meta

? Esquema de regulación XylS XylR     + + benzoatos xylS xylR xylXYLTEGFJQKIH xylUWCMABN Pu Pm upper meta tolueno   + Reguladores XylR ?

Examinar regulación en AUSENCIA de las rutas Fusiones transcripcionales Huésped heterólogo (Escherichia coli) Promotor Gen marcador desprovisto de promotor propio xylS xylR Pm:: ‘lacZ E. coli E. coli (pKT570, pJLR107) Inductor Actividad -galactosidasa Ninguno - 3-metilbenzoato + Xyleno + • Xyleno NO tiene que ser metabolizado para activar la ruta meta

Expresión de XylS en P. putida mt-2 Altas concentraciones de XylS en la células activan la ruta meta en ausencia de inductor Expresión de XylS en P. putida mt-2 P. putida (pWW0) Inductor niveles de mRNA de xylS Ninguno 10 3-metilbenzoato 10 Xyleno 100 xileno xylS 3-metilbenxzoato ninguno Xyleno (XylR) activa la síntesis de XylS

XylS XylR      + Pr1 Pr2 xylR Ps1 xylS xylXYLTEGFJQKIH xylUWCMABN Pu      tolueno benzoatos Ps2 Pm upper meta Reguladores XylR XylS

XylS XylR      32/38 - + 54 70 IHF Pr1 Pr2 xylR xylXYLTEGFJQKIH xylUWCMABN Pu   -    tolueno 54 IHF Ps2 benzoatos Pm upper meta Reguladores 70 XylS XylR Ps1 xylS BenR

Reguladores XylR C • Activa a los promotores Pu y Ps • Es dependiente de 54 (familia NtrC) • Reprime su propia expresión • IHF activa en Pu y reprime en Ps • En Ps HU es necesaria • Requiere activación por un efector • Represión dependiente de la presencia de otras fuentes de C

Perfil de efectores A B C D Mutagénesis química Regulador - 3-MBA 2NT CH2OH CH3 CH3 NO2 Mutagénesis química Regulador - 3-MBA 2NT 3-NT XylR 180 XylR6 1150 XylR49 1500 XylR7 150 XylR49-7 70 1050 1900 2600 900 1000 2900 3550 950 90 450 3000 A B C D 85 Pro  Ser 135 Asp Asn 172 Glu Lys

Represión catabólica Sistema PTS CRC? Otro? Cultivo contínuo Tasa de dilución (h-1) Expresión de la ruta upper Cultivo contínuo (limitación de C) 0.05 0. 5 0.75 Crecimiento Expresión de la ruta upper Inductor Medio rico Limitación Expresión de la ruta upper Cultivo contínuo (0.05 h-1) C O2 N P S Sistema PTS CRC? Otro?

Elementos que participan en la regulación 54-polimerasa xylS xylR XylR IHF 70-polimerasa Elementos que participan en la regulación XylR Activa Reprime IHF Facilita Impide 54 + Efector + ¿ Represor?

Expresión de la ruta meta Reguladores Crecimiento Expresión de la ruta meta Inductor 32 38 XylS • Activa al promotor Pm • Pertenece a la familia AraC • Es dependiente de 32 y 38 • Requiere activación por un efector Extremo N-terminal C-terminal a1 a2 a3 a4 a7 a6 a5

XylS X Pm :: ‘lacZ - 39 2FBz 343 Bz 6369 3FBz 6801 2MBz 2724 4FBz 2886 Efector Actividad Efector Actividad - 39 2FBz 343 Bz 6369 3FBz 6801 2MBz 2724 4FBz 2886 3MBz 13452 2ClBz 141 4MBz 3377 3ClBz 9034 2,3DMBz 6491 4ClBz 2991 2,4DMBz 1737 2,6DClBz 397 2,5DMBz 4093 3,5DClBz 381 2,6DMBz 383 2BrBz 547 3,4DMBz 4630 3BrBz 5372 3,5DMBz 385 4BrBz 1726 X

XylS Pm :: tet • Mutagénesis química de XylS (NTG) • Selección de resitencia a Tetraciclina: - Constitutiva. - Inducible por distintos efectores. • Identificación del residuo mutado Extremo N-terminal C-terminal Motivo HTH-1 Motivo HTH-2 a1 a2 a3 a4 a7 a6 a5 Unión del efector

XylS/Pm:lacZ wt 8000 -galactosidase (Miller U) 4000 rpoS rpoH 2 4 6 8 Time (h)

- 32 + DnaKJ Respuesta HS Proteínas desnaturalizadas estress NO estress - Promotores dependientes de 32 32 +

32 + DnaKJ Respuesta HS Proteínas desnaturalizadas estress Promotores dependientes de 32 32 +

3-metilbenzoato -Galactosidase (Miller U) Respuesta a choque térmico 3-metilbenzoato -Galactosidase (Miller U) PrpoDhs-lacZ

38 + 32 - 54 70 HS XylS Pm FtsH XylR Pu (XylR) IHF Fase estacionaria 32 38 XylS XylR (XylR) Pm + Pu COOH benzoato CH3 tolueno HS 70 FtsH 54 IHF Limitación anabólica -

Incidencia sobre otras poblaciones Consecuencias • Represión catabólica: MEZCLAS • Activación del regulador: INDUCIBILIDAD La inacapacidad de una cepa para degradar un determinado compuesto aromático puede tener dos causas: - Enzima(s) no reconocen el sustrato - El regulador no reconocen al inductor, no se activa la ruta • Plásmido % células TOL+ 100 50 tiempo benzoato o-xyl tolueno Transferible Incidencia sobre otras poblaciones Tol tiene además 2 transposones! Inestable Retrotransferencia

TOL TOD TOM TBU T4MO P. putida mt-2 P. putida F1 B. cepacia G4 R. pickettii PK01 T4MO P. mendocina KR1

     + + - + - Cromosoma (ruta orto) P. putida mt-2 benABC(DKEF) PbenA benR PbenR   benzoato XylS + catBCA PcatB catR PcatR +   - cis,cis-muconato  pcaK pcaF pcaTB(DC) pcaR PpcaR b-cetoadipato + - PpcaK PpcaF PpcaT pcaIJ PpcaI

-P P-   + A B C1 X D R* F E I G H C2 tod T S cromosoma tolueno P. putida F1 TOD A B C1 X D R* F E I G H C2 tod T S cromosoma todXFC1C2BADEGIH todST PtodX PtodS  P-  -P + tolueno Tolueno dioxigenasa meta Reguladores

  + 54 tbm A B C D E F plásmido Burkholderia sp. JS150 TOM Tolueno 2-monooxigenasa plásmido tbmABCDEF PtbmA tb4m  tolueno  tbmR 54 + Regulador Tolueno/benceno 2-monooxigenasa Tolueno 4-monooxigenasa

Tolueno 3-monooxigenasa Ralstonia pickettii PKO1 TBU B tbu A1 U V A2 C T X D R S F E W I K G J H cromosoma Operón meta Tolueno 3-monooxigenasa Fenol hidroxilasa Proteína de membrana tbuR tbuS tbuA1UVBVA2CT PtbuA1 tbuX PtbuX 70? 54  JIKGFEW tbu PtbuW tbuD PtbuD ANR?  tolueno    + meta Tolueno 3-monooxigenasa regulador Fenol hidroxilasa Proteína de membrana Reguladores

p-cresol metilhidroxilasa p-hidroxibenzaldehído P. mendocina KR1 T4MO C tmo A B D E F pcuCAB pobA cromosoma Tolueno 4-monooxigenasa p-cresol metilhidroxilasa + p-hidroxibenzaldehído deshidrogenasa p-hidroxibenzoato hidroxilasa

D C A B S R tdi bss ? E tut tutB A D B C E G F I H bbs fdx had oah dch Thauera aromatica K172 D C A B S R tdi bss reguladores bencilsuccinato sintetasa ? E tut tutB A D B C E G F I H bbs fdx had oah dch bcr B A D C benzoilCoA reductasa

Bencilsuccinato sintetasa Thauera aromatica K172 -P P- tolueno   + PtdiS tdiSR PbssD bssDCAB Reguladores Bencilsuccinato sintetasa

Características de la regulación En todos los casos estudiados, las enzimas sólo están presentes cuando las células se cultivan en presencia de tolueno: INDUCIBLES Reguladores del tipo de 2 componentes Sometidos a represión catabólica Anaerobias facultativas Expresión reprimida en presencia de O2 AadR (FNR) Activación en respuesta a anaerobiosis Cuando la cepa puede degradar tanto en aerobiosis como en anaerobiosis, las rutas y su regulación son distintas.