Purificación de fusiones a GST
Esquema de obtención de proteínas nativas clivadas del Tag
Uds. tienen pellets de bacterias que expresan GST-GFP Vamos a hacer purificación en batch… ¿Qué es eso? Protocolo: Resuspender pellets en 500 ul de TBS + PMSF + EDTA. TODO EN HIELO!!! Sonicar 3 pulsos de 20 segundos. Agregar Triton X-100 para que quede 1% final (yo les doy 10%, cuanto usan?) Centrifugar 10 min a 14.000 rpm a 4º C (centrífuga refrigerada) ¿Por qué? Incubar el SN con resina glutation-agarosa (50 ul bed vol) 1H a 4º C. Lavar x 3 con 500 ul TBS-Triton X-100 1%. OJO!: no llevar la resina!!!!! Cortar con Trombina (10 U, está 1 U/ul) durante 1 H, en 50 ul TBS-CaCl2 3 mM a temperatura ambiente con agitación. Sacar SN, pasar a tubo nuevo y guardar. Lavar con 500 ul TBS-Triton X-100 1% (esto es para lavar la GFP libre que haya quedado). Eluir el remanente de GST-GFP (no todo se va a cortar) con 50 ul de glutation reducido 10 mM preparado en Tris-HCl 50 mM, pH 8. Incubar 10 min. Tomar el SN, pasar a tubo nuevo y guardar.
Protocolo en imágenes Centrifugar 10´a 14000 rpm Sonicar Agregar T X-100 1% final Resusp. Pel en TBS PMSF/EDTA Pasar SN a tubo c/Glutation Agarosa Incubar 1 H a 4º C Centrifugar y lavar x 3 c/TBS-T X-100 1% Incubar c/10 U trombina 1 H tº amb Pasar SN a tubo nuevo, rotular y guardar (GFP libre) Lavar c/TBS-T X-100 Incubar c/Glut Red 10 mM 10´ c/mov Pasar SN a tubo nuevo, rotular y guardar (GST + GST-GFP remanente)