LA CROMATOGRAFÍA DE GASES Y SUS APLICACIONES 22 DE OCTUBRE DE 2007 INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍA DE GASES Introducción a la cromatografía. Definición Principios básicos Cromatografía de Gases Campo de aplicación Partes de un cromatógrafo de gases Nos cengtraremos en los métodos cromatográficos instrumentales, dejaremos por tanto a un lado los métodos cromatográficos basados en el uso de papel o capa fina para dar importancia a los métodos en columna en los que se puede controlar con gran precisión, el volumen de muestra inyectada, el flujo de fase móvil y que llevan asociados técnicas de detección de los componentes una vez separados muy variadas. Utilizando los distintos sistemas de detección se observará cada compuesto en forma de pico cromatográfico

INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍA Definición Principios básicos to t1 t2 A B A B Flujo de fase móvil Definición “Técnica que permite separar los componentes de una muestra debido a su diferente afinidad entre dos fases inmiscibles entre sí, una estacionaria (liquida o sólida) y otra móvil (gas o líquida)”

La muestra se introduce en la fase móvil y es transportada a lo largo de la columna que contiene una fase estacionaria distribuida. Las especies de la muestra experimentan interacciones repetidas (repartos) entre la fase móvil y la fase estacionaria. Cuando ambas fases se han escogido de forma adecuada, los componentes de la muestra se separan gradualmente en bandas en la fase móvil. Los componentes abandonan la columna en orden creciente de interacción con la fase estacionaria. La amplia gama de selección de materiales para la fase móvil y la estacionaria permite separar moléculas que difieren muy poco en sus propiedades físicas y químicas.

Clasificación de los métodos cromatográficos Cromatografía Cromatografía de gases Cromatografía de líquidos Gas –Líquido GLC Gas –Sólido GSC Líquido –Líquido LLC Líquido –Sólido LSC Intercambio iónico IEC Exclusión EC Casos particulares: Intercambio Iónico: Los componentes iónicos de la muestra se separan por el intercambio selectivo con contraiones de la fase estacionaria Exclusión: La fase estacionaria proporciona una clasificación de moléculas basada en la geometría y el tamaño molecular

Comportamiento cromatográfico de los compuestos El comportamiento cromatográfico de un componente de una muestra puede describirse de diversas formas: VR Volumen de retención Volúmen de fase móvil necesario para transportar la banda de un componente desde el punto de inyección, a través de la columna, hasta el detector (en el máximo de pico del componente) tR tiempo de retención Tiempo necesario para que el componente, una vez inyectado pase a través de la columna y alcance el detector (en el máximo de pico del componente) k´ razón de reparto Es una medida del tiempo que el componente está en la fase estacionaria en relación con el tiempo que está en la fase móvil

Flujo de fase móvil Señal tiempo to t1 t2 tB tA to A B t1 A B t2 A B tB A tA

Donde tM es el tiempo de retención de Señal tiempo to tB tA k´ razón de reparto tR – tM VR - VM k´= = tM VM Donde tM es el tiempo de retención de un compuesto que no interaccionara con la fase estacionaria y tR es el tiempo de retención del compuesto de interés. Lo mismo se puede expresar en relación con Los volúmenes de retención.

El objetivo de la cromatografía es doble: Separar los distintos componentes de la muestra Identificar los componentes previamente separados Separar los distintos componentes de la muestra Selectividad y eficiencia Buena selectividad Eficiencia baja Baja selectividad Buena eficiencia Buena selectividad Buena eficiencia

Identificar los componentes previamente separados Selección de detectores adecuados que permitan el análisis cualitativo. La selección de un detector está relacionada con la naturaleza de las sustancias a determinar. Los componentes de una muestra se identifican por su tiempo de retención Se pueden emplear técnicas que aporten una mayor información sobre la naturaleza de los componentes: Acoplamiento con Espectrometría de Masas Análisis Cuantitativos basados generalmente en la integración del área bajo los picos. Calibración con patrones o estándares: Si se realizan determinaciones cromatográficas de muestras de concentración conocida de alguno de sus componentes, se puede realizar una recta de calibrado y posteriormente el análisis e integración de una muestra de concentración desconocida del citado componente permitirá la cuantifcación del mismo. Estándar interno: Permite que varíen las condiciones de operación entre muestra y muestra.

Cromatografía de Gases “Es la técnica a elegir para la separación de compuestos orgánicos e inorgánicos térmicamente estables y volátiles” Un cromatógrafo de gases consiste en el acoplamiento de varios módulos básicos ensamblados para: Proporcionar un flujo constante de gas portador Permitir la introducción de vapores de la muestra en la corriente de gas que fluye Contener la longitud apropiada de fase estacionaria Mantener la columna a la temperatura apropiada (o la secuencia del programa de temperatura) Detectar los componentes de la muestra a medida que eluyen de la columna Proveer una señal legible proporcional en magnitud a la cantidad de cada coomponente

Cromatografía de Gases

Cromatografía de Gases

Cromatografía de Gases

Sistema de inyección El modo estándar es la inyección directa, la muestra es inyectada con una jeringa a través de un septum de goma a un alineador de vidrio donde es vaporizada y transportada por el gas al interior de la columna. El bloque de inyección, se mantiene a una temperatura tal que permita convertir prácticamente de forma instantánea la muestra líquida en un tapón de vapor. Existen jeringas especiales para muestras gaseosas. También se puede emplear un lazo o bucle para incoporar las muestras gaseosas al flujo de gas portador

Sistema de inyección El modo de separación más extendido en la actualidad se basa en el empleo de columnas capilares. Estas columnas requieren muy pequeños volúmenes de muestra. Esto se logra empleando un inyector que incorpora un divisor de flujo (split). Normalmente se introduce en la columna un 1% Cuando las sustancias a separar se encuentran a muy bajas concentraciones se realiza inyección sin divisor (splitless)

Sistema de inyección Para el análisis de compuestos orgánicos volátiles en muestras sólidas y líquidas, se han desarrollado algunas técnicas auxiliares: Espacio de cabeza (Head space) Purga y trampa (Purge and trap)

Espacio de cabeza (Head space) Se analiza la fase de vapor en equilibrio termodinámico con la muestra en un sistema cerrado. Para ello se procura un equilibrio estable, mediante el control de la temperatura del vial que contiene la muestra. Posteriormente, se arrastra la fase vapor al interior del cromatógrafo. T equilibrio Gas portador A la columna

Purga y trampa (Purge and trap) Es aplicable solo a muestras líquidas. Consiste en la continua renovación del gas en equilibrio con la muestra, con lo que se consigue el desplazamiento dinámico de los compuestos volátiles de la muestra líquida a la fase gaseosa. Los vapores se arrastran a una trampa donde quedan retenidos y se van concentrando. Finalizado el proceso se calienta la trampa y se arrastran los vapores al interior del cromatógrafo. 1) Gas portador 2) Gas portador trampa trampa A la columna T baja T alta T T

Columnas cromatográficas Columnas capilares Columnas Empacadas

Columnas cromatográficas empacadas Se construyen con tubo de acero inoxidable, niquel o vidrio. Los diámetros interiores van de 1,6 a 9 mm. La longitud suele ser inferior a los 3 m. Se rellenan de un material adsorbente adecuado a las sustancias que se quiere separar.

Columnas cromatográficas capilares Se construyen con sílice fundida. Los diámetros interiores suelen ser de 200-250 mm. La longitud suele ser superior a los 20 m. Hay dos tipos: Empacadas con partículas sólidas ocupando el total del diámetro de la columna (micro-empacadas) Tubulares abiertas, con trayectoria para el flujo abierta y sin restricción por el centro de la columna

Ejemplos de fases estacionarias en cromatografía de gases Separaciones por punto de ebullición de compuestos en un intervalo amplio de pesos moleculares: Escualano Polidimetilsiloxano Para hidrocarburos insaturados y otros compuestos polidifenildimetilsiloxano policarboranometilcianoetilsilicón Para compuestos nitrogenados poliamida policianoetilmetilsilicon Para alcoholes, ésteres, cetonas y acetatos polietilenglicol pentaeritritol tetracianoetilado

Horno Las columnas cromatográficas se enrollan, se sujetan en un soporte y se introducen en el interior de un horno El horno debe poderse calentar y enfriar rápidamente La temperatura se debe poder programar para poder trabajar en régimen de gradiente Muchas aplicaciones y métodos cromatográficos requieren comenzar a temperaturas por debajo de la ambiental

Horno T1 T2> T1

Sistemas de detección Características ideales de un detector para Cromatografía de Gases:   Sensibilidad alta y estable; típicamente 10-8 g soluto/s   Bajo nivel de ruido   Respuesta lineal en un amplio rango dinámico   Tiempo de respuesta corto   Buena respuesta para toda clase de compuestos orgánicos   Insensibilidad a las variaciones del flujo y la temperatura   Estabilidad y robustez   Simplicidad en su operación   Identificación de compuestos positiva   Técnica no destructiva   Pequeño volumen en prevención del mezclado de componentes

Sistemas de detección Este detector añade hidrógeno al Detector de ionización de llama (FID) Este detector añade hidrógeno al eluyente de la columna. La mezcla pasa a través del conducto de un mechero, donde se mezcla con aire externo y luego arde. Cuando entra en la llama material ionizable del eluyente de la columna Se quema y la corriente aumenta notablemente. Este detector es ideal para compuestos oxidables. No responde a los compuestos de carbono totalmente oxidados, como carbonilos o carboxilos y grupos éster

Sistemas de detección Detector de conductividad térmica (TCD) Utiliza un filamento caliente colocado en el flujo de gas emergente. La cantidad de calor por conducción que pierde el filamento hacia las paredes del detector depende de la conductividad térmica de la fase gaseosa. Es útil para determinar la presencia incluso de pequeñas cantidades de materiales orgánicos que producen una reducción relativamente grande en la conductividad térmica del eluyente de la columna.

Sistemas de detección El eluyente pasa entre dos electrodos. Uno de los electrodos tiene en su superficie un radioisótopo que emite electrones de alta energía conforme decae. Los electrones bombardean el gas portador (N2) formándose un plasma que contiene iones positivos, radicales y electrones térmicos. Se aplica una diferencia de potencial de modo que se recolectan los electrones generados. Los compuestos que absorben electrones reaccionan con los electrónes térmicos disminuyendo la corriente del detector, la cual es medida y permite la cuantificación Detector de captura de electrones (ECD)

Sistemas de detección Los eluyentes son ionizados y fragmentados. Los iones resultantes se dirigen a través de un cuadrupolo y se ordenan en función de su masa. Ese detector permite obtener el espectro de masas del compuesto que ha eluido. Podemos por tanto conocer, además del tiempo de retención el espectro de masas del compuesto y contrastarlo con bibliotecas de espectros. Se trata por tanto de un detector universal para la mayoría de los compuestos conocidos. Detector de espectroscopía de masas (MS)

Cromatografía Iónica

Polaridad Basándose en la polaridad de la fase estacionaria y la fase móvil, se distinguen los siguientes métodos de cromatografía líquida: Polaridad de la fase estacionaria Polaridad de la fase móvil iónico polar no polar Cromatografía en fase normal Cromatografía en fase reversa Cromatografía de pares iónicos Cromatografía iónica

El intercambio iónico como mecanismo de separación La gran mayoría de las separaciones por cromatografía iónica ocurren por intercambio iónico sobre fases estacionarias con grupos funcionales cargados. Los correspondientes contraiones del eluyente se localizan en la vecindad de los grupos funcionales y se intercambian con iones del analito de la misma carga en la fase móvil. Para cada ion el proceso de intercambio se caracteriza por un equilibrio de intercambio iónico correspondiente, que determina la distribución del analito (M+ ó A-) entre la fase móvil y la fase estacionaria: A- es el ion del analito E- es el ion del eluyente (contraion)

El intercambio iónico como mecanismo de separación El grupo más importante de intercambiadores iónicos son los basados en resinas sintéticas hechas de un copolímero de estireno y divinilbenceno. Los intercambiadores catiónicos se obtienen por posterior sulfonación de esta resina de estireno-divinilbenceno. Los intercambiadores aniónicos por posterior clorometilación seguida de aminación. Intercambiador catiónico Intercambiador aniónico

Cromatografía iónica También llamada cromatografía de intercambio iónico, determina iones inorgánicos y orgánicos, normalmente por conductividad. Se utilizan dos tipos de técnicas en la práctica: Supresión química, en la que la conductividad de fondo se suprime tanto química como electrónicamente. Normalmente utilizada en aniones. Supresión electrónica, en la que se emplean eluyentes con sales de ácidos orgánicos en baja concentración sobre intercambiadores de iones de muy baja capacidad para alcanzar una conductividad de fondo relativamente baja, que puede ser suprimida directamente por medios electrónicos.

Supresión química Se basa en el uso de sales de ácidos débilmente disociables (NaHCO3, por ejemplo) como eluyentes. Estos eluyentes se pueden eliminar en gran medida mediante una reacción post-columna de acuerdo con el siguiente proceso El ácido carbónico formado como resultado del intercambio catiónico se disocia muy débilmente, por lo que aporta poca conductividad. Por otro lado, los iones de la muestra sufren la reacción correspondiente. Por ejemplo, para el cloruro El proceso de supresión convierte el NaCl al correspondiente ácido fuerte, el cual tiene una mayor conductividad que la sal original. Cuanto menor fuerza tenga el ácido producido, el incremento en sensibilidad debido a la supresión química será menor.

Supresión química Eluyente - bomba Separación Supresión Detección Inyección de muestras Separación Supresión Detección

Aniones Sin supresión química Eluyente: ácido ftálico Con supresión química Eluyente: HCO3-/CO3- Aniones

Cationes sin supresión química Tartárico: 2,3-Dihydroxybutanedioic acid Dipicolinico: 2,6-Pyridinedicarboxylic Acid Cationes sin supresión química

Eluyente - bomba Inyección de muestras Separación Supresión Detección

Detección por conductividad La conductividad es una medida de la capacidad que tienen las disoluciones de electrolitos para transportar la corriente por migración iónica en un campo eléctrico aplicado entre dos electrodos. La conductividad (κ) es directamente proporcional a la concentración para disoluciones diluidas, siguiendo la relación Donde Λ es la conductividad equivalente en Scm2mol-1 c(eq) es la concentración equivalente en eq/l o normalidad

Eluyente - bomba Separación Detección Inyección de muestras Derivatización Detección

Detección UV/VIS Directa: Se usa en la determinación de iones que absorben fuertemente en el rango UV (nitrito, nitrato y aniones orgánicos, p.e.) en presencia de altas concentraciones de iones inorgánicos (cloruro, fosfato y sulfato, p.e.) que tienen escasa o nula absorción UV. Indirecta: Se utiliza con eluyentes de alta absorción UV (ftalato, p.e.). De este modo, los iones con menor actividad UV que el eluyente darán picos negativos y los iones con mayor actividad UV que el eluyente darán picos positivos. Con reacción post-columna: Usada en la detección de metales de transición (Fe, Ni, Cu, Mn y Zn, p.e.)

Eluyente - bomba Separación Detección Inyección de muestras DC: Amperometría de corriente contínua PAD: Detección amperométrica de pulsos Eluyente - bomba Inyección de muestras Separación Detección

Detección electroquímica Se utiliza ocasionalmente. Requiere que los iones a determinar sean susceptibles de oxidarse o reducirse. Entre ellos hay muchos compuestos orgánicos (azúcares y aminas, p.e.), metales de transición y aniones como nitrito, nitrato, haluros, sulfuro, cianuro, sulfito y sulfato. Hay cuatro técnicas diferentes : Amperometría: Medida de la corriente a potencial constante Culombimetría: Medida de la corriente a potencial constante con 100% de conversión del analito Voltametría: Medida de la corriente frente al potencial en un rango definido de potencial Amperometría de pulsos: Medida de la corriente a pulsos de potencial constante

Estado, cantidad y preparación de muestras Los líquidos que sean acuosos o miscibles en el agua se pueden analizar directamente. Los líquidos, sólidos y gases inmiscibles en agua deben ser extraídos o disueltos en disolución acuosa antes del análisis. El volumen típico a analizar es de 5 a 200 µl, aunque se puede partir de volúmenes tan grandes como 100 ml, utilizando técnicas de preconcentración cromatográficas cuando se requiera una mayor sensibilidad. Dilución y filtración son los procedimientos más comunes de preparación de muestras. Se requiere extracción para muestras no acuosas o preconcentración para muestras diluidas. La necesidad de derivatización precolumna es rara.

Técnicas complementarias Absorción atómica, emisión atómica y plasma de acoplamiento inductivo. Se usan para determinar la cantidad total de un metal en vez de una cierta forma iónica.