TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA

Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Las enzimas de restricción. Aislamiento de ADN foráneo. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector/ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Obtención de genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

1. Introducción: la clonación molecular La clonación consiste en la obtención de un clon, entendido como un conjunto de elementos genéticamente iguales entre si e iguales a su precursor. - Amplificación de moléculas de ADN por clonación célular Amplificación de moléculas de ADN por clonación acelular (PCR) - Manipulación genética y clonación de organismos pluricelulares (animales y plantas)

1. Introducción: la clonación molecular ... ¡¡ Dios mío, me han clonado... !!

1. Introducción: la clonación molecular Estrategia general del proceso de clonación Extraer el gen de interés insulina

Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Las enzimas de restricción. Aislamiento de ADN foráneo. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector/ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Obtención de genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

Plásmidos bacterianos 1. Introducción: la clonación molecular Aislamiento y digestión del ADN Herbert Boyer (Unversidad de Columbia) Enzimas restricción Inserción en moléculas vectores Stanley Cohen (Universidad de Stanford) Plásmidos bacterianos . con capacidad autónoma de replicación en la célula hospedadora

2. Las enzimas de restricción Fosfodiesterasa de veneno de serpiente Los ácidos nucleicos son hidrolizados por nucleasas Exonucleasas: atacan por un extremo determinad de la cadena nucleotídica exonucleasa a o 3’ exonucleasa b o 5’ Endonucleasas: atacan de forma selectiva una secuencia nucleotídica Enzimas de restricción

EcoRI actuando sobre una secuencia de ADN 2. Las enzimas de restricción EcoRI actuando sobre una secuencia de ADN

1. Introducción: la clonación molecular Estrategia general del proceso de clonación 1. Aislamiento del ADN foráneo 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector-DNA foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

1. Introducción: la clonación molecular 1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector 1. Introducción: la clonación molecular Estrategia general del proceso de clonación 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector- ADN foráneo en la célula hospedadora Cortar el ADN foráneo y el vector con las mismas enzimas de restricción 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas Métodos de aislamiento de ADN foráneo (a) Endonucleasas de restricción Tipos I, II, III EcoRI

2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas Tipo I y Tipo III  Actividad restricción y modificación  Precisan Mg 2+, ATP y S-adenosil-metionina  Reconocen una secuencia específica  Recorren un cierto número de bases y cortan Tipo II  Rompen por la secuencia de reconocimiento  Precisan Mg 2+, pero no ATP

2. Las enzimas de restricción Los ácidos nucleicos son hidrolizados por nucleasas Ejemplos de endonucleasa extremos cohesivos 5’ 3’ G↓A A T T C C T T A A↑G 3’ 5’ C C G G G G C C extremos romos

Secuencias Palindrómicas 2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas Acción de endonucleasas de restricción Tipo II: corte ADN EcoR 1 de E.coli G A A T T C Secuencias Palindrómicas C T T A A G A A G C T T Hind III de T T C G A A Haemophilus influenza

Secuencias Palindrómicas 2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas Acción de endonucleasas de restricción Tipo II: corte ADN EcoR 1 de E.coli Secuencias Palindrómicas G A A T T C Extremos cohesivos C T T A A G

G A A T T C C T T A A G A A T T C G G C T T A A 2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas EcoR 1 de E.coli G A A T T C C T T A A G A A T T C G G C T T A A Extremos pegajosos

2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas Extremos cohesivos Extremos romos

2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas Métodos de aislamiento de ADN foráneo (a) Cortes: Endonucleasas de restricción (Tipos I, II, III) Fragmentación mecánica Síntesis de DNA a partir de RNAm: Transcriptasa reversa Síntesis química directa (b) Síntesis

Transcriptasa reversa 2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas Síntesis de ADN a partir de ARNm Transcriptasa reversa ADN cDNA transcripción ARN polimerasa Transcriptasa reversa ARN traducción PROTEÍNA RNA La mayoría de las células Retrovirus RNA

2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas Síntesis de ADN a partir de ARNm Transcriptasa reversa

Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

1. Introducción: la clonación molecular 1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector 1. Introducción: la clonación molecular Estrategia general del proceso de clonación 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector- ADN foráneo en la célula hospedadora Vector de clonación Cortar el ADN foráneo y el vector con las mismas enzimas de restricción 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

Características principales 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Vectores de clonación Son vehículos de ADN para ADN, capaces de recibir ADN foráneo y replicarlo. Características principales Se replican de forma autónoma (origen de replicación) Contienen regiones no esenciales para su multiplicación y estabilidad

Contienen genes de resistencia a antibióticos. Virus 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Tipos de vectores: Plásmidos Permiten insertar hasta 20 kb de ADN pero son más eficaces con insertos más pequeños (<10kb). Contienen genes de resistencia a antibióticos. Virus Permiten insertar 15-20 kb. El sistema de infección del virus permite la entrada del ADN en E. coli. Los virus de cadena sencilla tienen aplicaciones especiales para secuenciar y realizar mutagénesis. Vectores híbridos: cósmidos. Permiten insertar hasta 40 kb.

Tipos de vectores de clonación 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Tipos de vectores de clonación Plásmidos (bacterianos) Virus Cósmidos (laboratorio) YACs (levaduras)

Plásmidos 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN ADN ADN Plasmídico ADN pBR322 -Control relajado -Fenotipo seleccionable -Cierto Nº de sitios de restricción -Bajo PM (4 363 bp) (transformación con plásmidos 10000bp es poco eficiente

Tipos de vectores de clonación 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Tipos de vectores de clonación Plásmidos (bacterianos) Virus Cósmidos (laboratorio) YACs (levaduras)

Para bacterias: Fago l y derivados, Fago M13 Para plantas: CaMV 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Virus: se emplea como vector, junto con la capacidad que poseen para introducir el ADN foráneo en la célula hospedadora Para bacterias: Fago l y derivados, Fago M13 Para plantas: CaMV Para mamíferos: SV40

Fago l Virus 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN -El corte por los sitios cos y el empaquetamiento en la cápsida puede hacerse in vitro. La cápsida admite entre 38 y 53 Kb (-20% y + 10% del DNA l). Se introduce en la bacteria hospedadora por transducción

Adsorción de particulas virales a una bacteria

SIDA

Tipos de vectores de clonación 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Tipos de vectores de clonación Plásmidos (bacterianos) Virus V Cósmidos (laboratorio) Mezcla plásmido y virus YACs (levaduras), contienes sitios característicos de la funcionalidad de los cromosomas

Un plásmido que posee el sito cos del fago l, 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN COSMIDO Un plásmido que posee el sito cos del fago l,

3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Vector YAC Levaduras 1000 kb

Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

1. Introducción: la clonación molecular 1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector Estrategia general del proceso de clonación 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector Vector de clonación 3.Introducción del vector- ADN foráneo en la célula hospedadora Cortar el ADN foráneo y el vector con las mismas enzimas de restricción 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

1. Introducción: la clonación molecular 1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector 1. Introducción: la clonación molecular Estrategia general del proceso de clonación 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector- ADN foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

Formación de ADN recombinante: unión ADN foráneo-vector 3. Vectores de clonación y unión del framento de ADN Formación de ADN recombinante: unión ADN foráneo-vector

Enzimas de restricción 3. Vectores de clonación y unión del framento de ADN Enzimas de restricción Vector ADN

Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

1. Introducción: la clonación molecular 1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector 1. Introducción: la clonación molecular Estrategia general del proceso de clonación 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector- ADN foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

4. Hospedadores. Introducción del ADN foráneo Métodos de inserción del ADN-vector en célula huesped Transformación: ADN plasmídico en célula. CaCl2 (mejora el proceso). Para plásmidos < 20 Kb Infección: directa del virus empaquetado in vitro Transducción: ADN vírico sin cápsida (menor rendimiento) Microinyección: para células grandes (eucariotas) con micromanipulación. Pistola o Bombardeo de partículas: para transformar vegetales. Conjugación: celular del ADN de dos células Fusión de Protoplastos: intercambio ADN, dos células sin pared celular W, Au

Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

1. Introducción: la clonación molecular 1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector 1. Introducción: la clonación molecular Estrategia general del proceso de clonación 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector- ADN foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

5. Métodos de selección MÉTODOS DE SELECCIÓN Resistencia a antibióticos Genes marcadores (gen b-galactosidasa) GFP (green fluorescent protein) Hibridación de colonias

Resistencia a antibióticos 5. Métodos de selección Resistencia a antibióticos La resistencia la confieren genes que porta el vector, en este caso a ampicilina y a tetraciclina El ADN foráneo se inserta en el gen de resistencia a Ampicilina Plásmido pBR322

Resistencia a antibióticos 5. Métodos de selección Resistencia a antibióticos La resistencia la confieren genes que porta el vector Sin plásmido Sin inserto Con plásmido Con inserto Con plásmido Sin inserto Con ampicilina y tetraciclina Con tetraciclina

5. Métodos de selección MÉTODOS DE SELECCIÓN Resistencia a antibióticos Genes marcadores (gen b-galactosidasa) GFP (green fluorescent protein) Hibridación de colonias

5-Br-4-Cl-3-indolil-b-galactósido  Br-Cl-indol + galactosa 5. Métodos de selección Amp Gal Ori pUC19 Genes marcadores (ej: gen b-galactosidasa) 5-Br-4-Cl-3-indolil-b-galactósido  Br-Cl-indol + galactosa (X-gal) (Azul) Inactivación insercional (introducir el DNA foraneo en el medio del marcador) Inserción génica positiva (Unir el gen marcador al DNA foraneo)

5. Métodos de selección Genes marcadores (gen b-galactosidasa) Gal + inserto Plasmido pUC19 Amp Gal Ori Amp Ori Plasmido pUC19

5. Métodos de selección Genes marcadores b-galactosidasa

X 5. Métodos de selección pUC19 = plásmido b-galactosidasa + ADN foráneo pUC19 = plásmido b-galactosidasa X

5. Métodos de selección MÉTODOS DE SELECCIÓN Resistencia a antibióticos Genes marcadores (gen b-galactosidasa) GFP (green fluorescent protein) Hibridación de colonias

5. Métodos de selección GFP (green fluorescent protein)

GFP (green fluorescent protein) 5. Métodos de selección GFP (green fluorescent protein) 510 488 Tubulina GFP-TUB 530 515 Retículo endoplásmico YFP-ER Peroxisomas GFP-PEROXI Núcleo YFP-NUC 475 420 Mitocondria CFP-MITO 600 550 RFP-MITO Membrana M-GFP Endosomas GFP-ENDO Ap. De Golgi CFP-GOLGI Actina GFP-ACTIN Emisión (nm) Excitación (nm) Localización Vector

1. Introducción: la clonación molecular 1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector 1. Introducción: la clonación molecular Estrategia general del proceso de clonación 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector- ADN foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

Genotecas Genoteca: colección de clones que contiene todo el genoma de un organismo. Tipos de genotecas: Genómicas Parciales ADNc. Colección de ARNm Tipos de vectores: Plásmidos (Genotecas parciales) Fagos (Genotecas genómicas pequeñas y de ADNc) Cósmidos, BAC (genotecas genómicas complejas)

Utilizando un plásmido 6. Obtención de genotecas Utilizando un virus Utilizando un plásmido

Hibridación de colonias 5. Métodos de selección Hibridación de colonias Consiste en detectar secuencias de DNA en colonias transformadas mediante hidridación “in situ” con sondas marcadas Obtención de la sonda marcada: marcaje radioactivo: (32P) marcaje desoxinucleótidos fluorescentes

Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

7. Electroforesis en geles de agarosa

TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS  Se basan en la migración diferencial de las moléculas a separar en un campo eléctrico.  Generalmente se lleva a cabo en un soporte inerte. (AGAROSA)  En la electroforesis en gel la fuerza que provoca la migración de las moléculas es el campo electrico, pero el gel actúa como filtro molecular, relentizando la migración su migración en función de su tamaño

7. Electroforesis en geles de agarosa

- Geles de acrilamida (proteínas, geles de secuenciación de ADN) ELECTROFORESIS. SOPORTES - Geles de acrilamida (proteínas, geles de secuenciación de ADN) Gelificación química - Geles de agarosa (los más usuales para ADN) Gelificación térmica

ELECTROFORESIS DE ADN  Disolver la agarosa a la concentración deseada en una solución salina TAE (Tris-acetato-EDTA) o TBS mediante calentamiento  Dejar enfriar hasta unos 50ºC y añadir Bromuro de Etidio Bromuro de Etidio

7. Electroforesis en geles de agarosa La agarosa es el polímero usado para la separación.

7. Electroforesis en geles de agarosa La agarosa se mezcla con un tampón.

7. Electroforesis en geles de agarosa La agarosa se disuelve en el microondas.

7. Electroforesis en geles de agarosa Se preparan la cubeta y el peine.

7. Electroforesis en geles de agarosa Se añade el polímero disuelto a la cubeta y se espera hasta su gelificación.

7. Electroforesis en geles de agarosa  El gel se coloca en una cubeta de electroforesis y se cubre con solución TAE Se procede a cargar los pocillos con las muestras Se procede a conectar a una fuente de electroforesis

7. Electroforesis en geles de agarosa Formados los “pocillos”, se coloca en ellos cada muestra, incluidos los patrones.

7. Electroforesis en geles de agarosa Cada muestra forma una banda azul que “correrá” en la agarosa dependiendo de su tamaño.

7. Electroforesis en geles de agarosa  El gel se coloca en una cubeta de electroforesis y se cubre con solución TAE

7. Electroforesis en geles de agarosa El gel se retira y el bromuro de etidio ligado al ADN se visualiza con transiluminador de UV, apareciendo bandas fluorescentes. Se coloca el gel en un transiluminador de luz UV Se visualizan las bandas de ADN teñidas con el bromuro de etidio.

7. Electroforesis en geles de agarosa  La movilidad electroforética del ADN en los geles de agarosa es inversa a su tamaño

Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

8. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kary Mullis. Premio Nobel de Química en 1993 8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Kary Mullis. Premio Nobel de Química en 1993 Descrubrió la PCR en 1985, cuando trabajaba para Cetus Corp. ”Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an afternoon”

8. PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR es básicamente una técnica de amplificación del DNA. DNA (molécula sencilla) PCR amplificación Muchas moleculas del mismo ADN

8. PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR es básicamente una técnica de amplificación del DNA. Controlando la temperatura DNA (doble hélice)

Síntesis por DNA polimerasa 8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9 Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G Cortos primers de DNA específicos que hibridan con la cadena que tiene que ser copiada los dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

Síntesis por DNA polimerasa 8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9 Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T

Síntesis por DNA polimerasa 8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9 Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A

Síntesis por DNA polimerasa 8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9 Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C

Síntesis por DNA polimerasa 8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9 Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G

Síntesis por DNA polimerasa 8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9 Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G T

Síntesis por DNA polimerasa 8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9 Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G T A

8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9 Después del primer periodo de síntesis de DNA, tenemos copiada una cadena de DNA Primer 1 Extensión de la cadena Cadena original de DNA ¿Cómo produce este proceso una AMPLIFICACIÓN?

8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9 Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (90 ~ 100°C)

8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9 Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (90 ~ 100°C) Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva cadena con la DNA polimerasa 2 1 Al mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente, dado que hay un exceso de Primer 1 Ahora tenemos dos copias de la molécula original

8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9 Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura Fusión 95°C Hibridización 50-60ºC Extensión de La cadena 75ºC 2do Ciclo 95ºC 50 - 60ºC 75ºC Primer Ciclo Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias Múltiples ciclos darán un incremento exponencial de copias

para amplificar los sandwiches? 8. PCR (Polymerase Chain Reaction) ADN-polimerasa de Thermus aquaticus (Taq –polimerasa) Parque Nacional de Yellowstone Hey, Boo Boo ¿pescamos lasTap para amplificar los sandwiches? Ok Yogy

8. PCR (Polymerase Chain Reaction)

8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Pelo humano

Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

METODO DE SANGER PARA LA SECUENCIACIÓN DE DNA 8. Métodos de secuenciación del ADN METODO DE SANGER PARA LA SECUENCIACIÓN DE DNA U K J

TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA