Biosensores “Instrumentos analíticos que transforman procesos biológicos en señales eléctricas u ópticas y permiten su cuantificación”

BIOSENSORES Utilizan la especificidad de los procesos biológicos: Enzimas x Sustratos Anticuerpos x Antígenos Lectinas x Carbohidratos Complementariedad de ácidos nucleicos. Ventajas: Reutilización Menor manipulación Menor tiempo de ensayo Repetitividad Tipos y usos mas comercializados: Tiras colorimétricas Electroquímicos: Potenciométricos: Glucosa, Lactato, Glicerol, Alcohol, Lactosa, L-aminoácidos, Colesterol Amperométricos: Glucosa, Sacarosa, Alcohol Ópticos: BIAcore: Ag proteicos.

Propiedades de un buen Biosensor

BIOSENSORES Control de metabolitos críticos durante las operaciones quirúrgicas. Consultas y Urgencias Hospitalarias: Obvia análisis caros y lentos en laboratorios centrales Acelera la diagnosis y el comienzo del tratamiento Menor riesgo de deterioro de la muestra Diagnóstico Doméstico: Ensayos de Embarazos Control de Glucosa en diabéticos Aplicaciones in vivo: Páncreas artificial Corrección de niveles de metabolitos Problemas : Miniaturización y Biocompatibilidad Aplicaciones Industriales, militares y medio ambientales: Alimentación Cosmética Control de Fermentaciones Controles de Calidad Detección de Explosivos Detección de gases nerviosos y/o toxinas biológicas Control de polución.

TIPOS DE BIOSENSORES BIOSENSORES ELECTROQUÍMICOS Amperométricos: Determinan corrientes eléctricas asociadas con los electrones involucrados en procesos redox Potenciométricos: Usan electrodos selectivos para ciertos iones Conductimétricos: Determinan cambios en la conductancia asociados con cambios en el ambiente iónico de las soluciones BIOSENSORES TERMOMÉTRICOS BIOSENSORES PIEZOELÉCTRICOS BIOSENSORES ÓPTICOS De onda envanescente Resonancia de plasma superficial BIOSENSORES CELULARES INMUNOSENSORES

UNIDADES FUNCIONALES DE UN BIOSENSOR

= Material biológico + Analito Analito unido Respuesta biológica Respuesta Electrónica (Máxima respuesta electrónica posible) x (Concentración del analito) (Constante de semisaturación) + (Concentración del analito) Respuesta electrónica =

Cinéticas de reacción en biosensores

TIPOS DE BIOSENSORES BIOSENSORES ELECTROQUÍMICOS Amperométricos: Determinan corrientes eléctricas asociadas con los electrones involucrados en procesos redox Potenciométricos: Usan electrodos selectivos para ciertos iones Conductimétricos: Determinan cambios en la conductancia asociados con cambios en el ambiente iónico de las soluciones BIOSENSORES TERMOMÉTRICOS BIOSENSORES PIEZOELÉCTRICOS BIOSENSORES ÓPTICOS De onda envanescente Resonancia de plasma superficial BIOSENSORES CELULARES INMUNOSENSORES

Biosensores Electroquímicos Amperométricos: “El electrodo de Oxígeno”

Electrodo de Oxígeno

Electrodo de Oxígeno (A) Disco de resina epoxy (B) Cátodo de platino en el centro de un saliente. (C) Ánodo de plata en forma circular (D) Anillo de goma que sostiene un papel espaciador empapado en un electrolito y una membrana de polytetrafluoroethylene que separa los electrodos de la mezcla de reacción.

DETERMINACION DE GLUCOSA

DETERMINACION DE GLUCOSA

DETERMINACION DE SACAROSA Invertasa Glucosa-oxidasa Glucosa D-gluconolactona H2O2 Electrodo Sacarosa Fructosa Glucosa flujo O2 glucosa sacarosa tiempo respuesta

DETERMINACION DE LA FRESCURA DEL PESCADO Tras la muerte, los nucleótidos del pescado sufren una serie de reacciones de degradación progresiva: ATP > ADP > AMP > IMP > HxR > Hx > Xantina > Acido úrico

DETERMINACION DE LA FRESCURA DEL PESCADO BIOSENSOR: xantina-oxidasa y nucleósdio fosforilasa inmovilizadas sobre una membrana de triacilcelulosa de un electrodo de Oxígeno. K < 20 El pescado puede ser comido crudo. 20 > K < 40 El pescado debe ser cocinado. K > 40 Pescado no apto para el consumo Los nucleótidos se podrían determinar utilizando el mismo electrodo y muestra, pero añadiendo nucleotidasa y adenosín-deaminasa

Varios mecanismos redox

Mediadores redox en biosensores amperométricos

Miniaturización Posible por la capacidad del pirrol para polimerizar mediante oxidaciones electroquímicas en condiciones suficientemente suaves como para atrapar enzimas y mediadores sin desnaturalizarlos

Microelectrodo glucosa/lactato Se puede recubrir la superficie de pequeños electrodos polimerizando pirroles junto con biocatalizadores y mediadores, utilizando métodos de micro fabricación de microprocesadores, en incluso disponiendo varios sensores en los mismos

Biosensores Electroquímicos Potenciométricos Determinan cambios en la concentración de iones concretos 3) BIOSENSORES POTENCIOMÉTRICOS Electrodo ión-selectivos (pHmetro) Miniaturizados mediante transistores de efecto de campo (FET) Baratos Necesidad de proteger el silicio de las soluciones Determinación de varios analitos Mayor Velocidad Muy poca muestra Necesidad de compensación de la temperatura.

Biosensores potenciométricos

Biosensor potenciométrico

Biosensores Electroquímicos Conductimétricos Detectan cambios en conductividad eléctrica causados por alteraciones en la concentración de iones

Sensor de Urea NH2CONH2 +3H2O Ureasa 2HN 4 + + HCO3- + OH- Otros ejemplos: amidasas, decarboxilasas, esterasas, fosfatasas y nucleasas.

Biosensores Termométricos: “Sensores bioquímicos y TELISA”

Biosensor termométrico Precisa un aislamiento Correcto Puede detectar diferencias de 0,0001 ºC

Reacciones usadas en biosensores termométricos

Biosensores Termométricos Poco éxito comercial Ventaja: se puede acoplar fácilmente varias reacciones en un único reactor Ejemplo: Detector de Lactato Lactato + O2------(lactato -oxidasa)---> piruvato + H2O Piruvato + NADH+ H+--(lactato deshidrogenasa)--> lactato + NAD+ Puede utilizarse células viables Puede acoplarse a un inmunoensayo enzimático: ELISA termométrico o TELISA

Biosensores Piezoeléctricos: “Narices bioelectrónicas” Aprovechan las propiedades eléctricas de los cristales: En transmisores y emisores de radio En transistores En chips

Efecto Piezoeléctrico “Producción de un campo eléctrico por separación de las cargas positivas y negativas en algunos tipos de cristales al someterlos a ciertas tensiones” Si un cristal piezoeléctrico se somete a un campo eléctrico se deformará. 2) Si un cristal piezoeléctrico se somete a un campo eléctrico que oscila a una frecuencia determinada vibrará con una frecuencia característica.

Efecto Piezoeléctrico La frecuencia de resonancia se encuentra en el rango de los 10 MHz (radiofrecuencia). La frecuencia de resonancia depende de: La composición del cristal El Grosor La forma en que fue cortado 3) Un cristal piezoeléctrico varía su frecuencia de resonancia cuando se adhieren moléculas a su superficie.

Biosensores Piezoeléctricos Se detectan variaciones muy pequeñas en la frecuencia de resonancia: cantidades de hasta un ngr/cm2 La medida se compra con un electrodo de referencia con cristal sin material biológico. Ejemplos: Detectores gaseosos: SO2, CO, HCl, NH3, CO2 Detector de Cocaina Detector de Formaldehido Detector de Pesticidas (Organofosforados)

Biosensores Piezoeléctricos Detector de Cocaína: Anticuerpos contra cocaína fijados sobre un cristal piezoeléctrico. Detecta una parte por billón 50 MHz de cambio en la frecuencia de resonancia. Se limpia en segundos por aireación.

Biosensores Piezoeléctricos 2) Detector de Formaldehido: CH2 +H2O +NAD+ gNADH +HC02H + H2 Catalizada por la formaldehido deshidrogenasa inmovilizada con glutation (cofactor) por entrecruzamiento con glutaraldehido en un cristal de cuarzo a 9 MHz

Biosensores Piezoeléctricos 3) Detector de Pesticidas Organofosforados: Colinesterasa inmovilizada en un cristal de cuarzo mediante glutaraldehido.

Biosensores Piezoeléctricos Inconvenientes: Muy influidos por la humedad. Baja = poco sensibles Alta = desaparece el efecto piezoelectrico Inutilizables en líquidos. Introducir y secar

Biosensores Ópticos: Permiten el uso de materiales detectores no eléctricos, seguros en ambientes peligrosos o sensibles (in vivo) No precisan sensores de referencia

Biosensor de fibra óptica para lactato Detecta cambios en la en la concentración de oxígeno determinando la reducción de la fluorescencia de un fluorocromo (quenching)

Biosensor de célula óptica para albúmina sérica Detecta la absorción de luz a 630 nm que pasa a través de la célula detectora. Se evalúa el cambio de amarillo a azul verdoso del verde de bromocresol cuando se une a la albúmina sérica a pH 3.8 Respuesta lineal a la albúmina en un intervalo de 5 a 35 mg/cm3

Biosensores Ópticos Detección de Vapores: Ensayo sólido colorimétrico que detecta vapor de alcohol utilizando alcohol-oxidasa, peroxidasa y 2,6-diclorindofenol sólidos dispersados sobre placas de TLC (cromatografía en capa fina) de celulosa microcristalina transparente. Tiras colorimétricas de un solo uso: Los más utilizados: análisis de sangre y orina. Control de la glucemia en diabéticos Glucosa oxidasa, peroxidasa de rábano y un cromógeno que cambia el color al ser oxidado Cromógeno (2H) + H2O2----(peroxidasa)--->colorante + 2H2O

Biosensores Ópticos 3) Reacciones luminiscentes: Utilización de luciferasa Detecta la presencia de microorganismos en orina al liberar ATP en su destrucción Luciferina + ATP----(luciferasa)---> oxiluciferina + CO2 + AMP + ppi + luz

Biosensores ópticos de onda evanescente Menor índice de refracción > Mayor índice de refracción > “Un haz de luz será reflejado en su totalidad cuando incida sobre una superficie transparente presente entre dos medios, cuando proceda del medio con mayor índice de refracción y cuando el ángulo de incidencia sea mayor que un valor critico”

Biosensores ópticos de onda evanescente Menor índice de refracción > Mayor índice de refracción > “En el punto donde se produce la reflexión, se induce un campo electromagnético que penetra en el medio que tiene menor índice de refracción” “Este campo es denominado onda evanescente y decae exponencialmente con la distancia de penetración, desapareciendo tras unos pocos nanómetros”

Biosensores ópticos de onda evanescente Menor índice de refracción > Mayor índice de refracción > “La onda evanescente decae exponencialmente con la distancia de penetración, desapareciendo tras unos pocos nanómetros” “La profundidad a la que penetra depende del índice de refracción, de la longitud de onda de la luz utilizada y puede ser controlada con el ángulo de incidencia.

Biosensores ópticos de onda evanescente Menor índice de refracción > Mayor índice de refracción > “La onda evanescente puede interaccionar a su vez con el medio, provocando un campo electromagnético que puede volver al medio con mayor índice de refracción, dando lugar a cambios en la luz que continúa a lo largo de la guía de ondas.”

Inmunosensor de onda evanescente Especialmente indicados para inmunoensayos: No es necesario separar el resto de los componentes de una muestra clínica La onda solo penetra hasta el complejo antígeno anticuerpo Se excitan fluorocromos unidos a la superficie mediante la onda evanescente, y la luz emitida por ellos volverá a la fibra óptica La cantidad de muestra necesaria es mínima

Resonancia de plasma superficial “Si la superficie del cristal está recubierta por una capa metálica (oro, plata, paladio) los electrones de su superficie pueden oscilar en resonancia con los fotones generando un onda de plasma superficial y amplificando el campo evanescente en la cara mas alejada del metal”

Resonancia de plasma superficial “Si la capa de metal es lo suficientemente delgada como para permitir al campo evanescente penetrar hasta la superficie opuesta, el efecto será muy dependiente del medio adyacente al metal”

Resonancia de plasma superficial “Este fenómeno sucede sólo cuando la luz incide con un ángulo específico, el cual depende de la frecuencia, el grosor de la capa metálica y el índice de refracción del medio que se encuentra inmediatamente sobre la superficie metálica”

Resonancia de plasma superficial “La producción de esta resonancia de plasma superficial absorbe parte de la energía de la luz reduciendo la intensidad de la luz reflejada internamente”

Resonancia de plasma superficial “Los cambios que suceden en el medio provocados por interacciones biológicas pueden ser apreciados detectando los cambios de intensidad de la luz reflejada o el ángulo de resonancia”

Cambio en la absorción por efecto de la resonancia de plasma superficial “Detección de la gonadotropina coriónica humana (hCG) mediante un anticuerpo unido a la superficie del biosensor: La unión cause un cambio en el ángulo de resonancia”

Resonancia de plasma superficial Permiten detectar partes por millón Un análisis típico requiere 50µl de muestra y tarda 5 a 10 minutos Puede utilizarse con DNA y RNA.

Biosensores celulares

Inmunosensores

Tipos de inmunosensores