Una nueva proteína de U2 snRNP de levadura, Snu17p, es requerida para el primer paso catalítico del splicing y para la progresión del ensamblaje del spliceosoma Matías Blaustein, Diego Pafundo, Ignacio Schor Gottschalk A., Bartels C., Neubauer G., Lührmann R., Fabrizio P. Traído a ustedes por:

Spliceosoma Spliceosoma: Asociación ordenada de 5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 y U6) y proteínas. 7 proteínas Sm, comunes a todos los snRNPs Un set de proteínas Sm-like (Lsm) Otras

Secuencia de eventos

Apareamientos y rearreglos entre los snRNAs y el pre-mRNA

Muchas proteínas pueden estar involucradas en estos switches… Por ejemplo: Prp28p Mediador potencial del switch U1  U6 del pre-mRNA Tiene un dominio DEAD-box ATPasa. ¿Desenrrollamiento del duplex RNA-RNA?

Caracterización de las proteínas del spliceosoma: genética (en levaduras) bioquímica (en varios sistemas) Así se encontraron muchas proteínas en levaduras homólogas a las proteínas involucradas al splicing en metazoos.

¿Qué pasa con la snRNP U2...? Se sabe poco del complejo de levaduras, porque es difícil de purificar. Se caracterizaron 9 proteínas de este complejo en humanos. Todas tienen homólogos en levaduras (por búsqueda de secuencias). ¿Qué se hace en este paper…? Caracterización de una nueva proteína asociada al splicing: Snu17p

¿De dónde salió Snu17p?

Purificación parcial del tri-complejo snRNP [U4/U6.U5] por cromatografía de afinidad y gradiente de glicerol Espectroscopía de masa Búsqueda en base de datos 28 proteínas asociadas con el tri-complejo [U4/U6.U5] Dos proteínas del factor asociado a U2 snRNPs, SF3b. ¡Snu17p!

¿Qué podemos saber de Snu17p?

1 1 Snu17p tiene un motivo de reconocimiento de RNA (RRM) Búsqueda de homólogos con BLAST de proteínas 50% de identidad con los primeros 120 aa de varias proteínas con RRM. Búsqueda TBLASTN en base de datos de EST humanos 36% de identidad y 53% de similitud con EST AA314241

p14 podría ser la verdadera ortóloga de Snu17p en humanos Este EST corresponde a una proteína llamada p14 que: tiene tamaño similar a Snu17p se encuentra asociada a U2 snRNP en humanos

¿Está Snu17p asociada con alguna SnRNP?

Generación de una cepa de levaduras que expresa Snu17p-tag en vez del gen endógeno Preparación de extractos de splicing Inmunoprecipitación con IgG-agarosa Lavado con concentraciones crecientes de sales Extracción de RNA y Northern blot

2 2 Snu17p es una proteína del snRNP U2

¿Está Snu17p asociada con el spliceosoma durante el splicing?

Extractos de splicing Pre-mRNAs de actina y de U3 marcados con 32 P-UTP Splicing in vitro 20´ 40´ 40´: inmunoprecipitación con IgG-agarosa Electroforesis en gel desnaturalizante Remoción:

3 3 Snu17p está asociada con el spliceosoma y en particular con el catalíticamente activo durante el splicing in vitro

3 3

3 3

3 3

¿Es esencial Snu17p para la viabilidad celular?

Knockout de SNU17 en una línea diploide, reemplazando por el marcador HIS3 Luego de la esporulación, las 4 esporas son viables Las dos esporas que llevan HIS3 tienen un crecimiento vegetativo 1,3 veces más lento que el wild type a distintas temperaturas

¿Es requerido Snu17p para el splicing?

Electroforesis en gel desnaturalizante Primer extension Extracción de RNA

4. A La deleción de Snu17p lleva a un splicing del pre- mRNA defectivo in vivo time

Extractos de splicing de cepas wt o snu17  Pre-mRNA de actina marcado con 32 P-UTP Splicing in vitro Electroforesis en gel desnaturalizante Remoción: 1´5´15´25´ GST-Snu17p

4. B La deleción de Snu17p lleva a la inhibición del splicing antes del primer paso catalítico in vitro

¿Afecta la ausencia de Snu17p al ensamblaje del spliceosoma?

Pre-mRNA de actina marcado + Extracto de levadura wt Extracto de levadura Snu17  Ensamblaje in vitro de spliceosomas (30°C) Electroforesis en gel no desnaturalizante Visualización de los complejos 0’10’20’ Heparina

5. A La ausencia de Snu17p produce la acumulación de un complejo inusual X.

¿Cuál es la composición del complejo X?

Extracto de levadura wt Extracto de levadura Snu17  Splicing in vitro con pre-mRNA de actina. Tratamientos: Mock Degradando U6 snRNA EDTA Electroforesis no desnaturalizante Hibridar con sondas de actina y de todos los snRNAs 0’5’20’ Heparina

6 6

6 6 !!! La estructura de U2 snRNP se encuentra comprometida en ausencia de Snu17p

6 6!!! U1 snRNP es parte del complejo X, incluso habiendo tratado con heparina.

6 6

6 6

6 6

U5 y U4 no se detectan bien por el método anterior...

Extractos de splicing de cepas wt o snu17  Pre-mRNA de actina biotinilado Splicing in vitro 5L5L RNA total 120  L Heparina Gradiente de glicerol 15 fracciones de la región 40S Se purifica c/u por afinidad con streptavidina-agarosa RNA purificado Northern blot

7 7 Este experimento independiente refuerza la conclusión de que el complejo X contiene todos los snRNPs

Conclusiones Snu17p es llamada a partir de aquí ha ser tenida en cuenta como pilar de U2 y resulta ser claro componente del spliceosoma, al menos hasta el segundo paso catalítico del célebre y fundamental proceso de splicing. La falta de presencia de Snu17p trae aparejada una formidable reducción del splicing in vitro. La mentada reducción es debida directamente a la falta de presencia de Snu17p, ya sea porque Snu17p es parte activa del extraordinario proceso de splicing o bien porque es menester su presencia para la correcta conformación y funcionamiento de U2. In vivo, si bien la falta de presencia de Snu17p produce un fenotipo de crecimiento poco veloz y por demás evidentes defectos en el majestuoso fenómeno de splicing, el efecto es menos drástico. Esto bien puede explicarse por la estabilización de U2 en las condiciones predominantes en el entorno fisiológico aún en ausencia de esta antaño ignota proteína.

La ausencia de Snu17p conlleva la formación de un ignominioso, lindante con lo impúdico complejo que alberga en su seno a U2, U6, U5 e incluso a los usualmente esquivos U4 y U1. Esto puede deberse a una conformación harto aberrante de U2 que no tiene a bien desplazar a U1. Snu17p recombinante revierte la formación del esotérico complejo X y restaura el magnánimo y fastuoso prodigio, conocido como splicing. Se puede colegir que la proteína p14 sería la contraparte funcional de Snu17p en el spliceosoma humano (por identidad, similar talla y porte y por permanecer asociado a U2). La falta de Snu17p, en marcado contraste con otras proteínas de U2, permite la acción y efecto de incorporar U2 al prespliceosoma y del tri- snRNP [U4/U6.U5] inhibiendo la progresión del ensamblaje antes de la liberación de U1 y luego de la incorporación del tri-snRNP. Notablemente, esto sentaría un hito para el perfeccionamiento de una herramienta idónea para el aislamiento de spliceosomas totalmente ensamblados, detenidos, congelados y acorralados antes del primer paso catalítico del excepcional mecanismo de splicing.

Fin