Fernando Esteban Hernández Huerta Inducción del metabolismo Parte I. Regulación genética en el operon lac Facultad de química, UNAM Laboratorio de bioquímica experimental Grupo: Profesoras: Sobeida Sánchez Nieto Lilian González Segura Fernando Esteban Hernández Huerta

La adaptabilidad de las bacterias y otros procariontes depende en grado considerable de su capacidad de encender y apagar la expresión de series especificas de genes en respuesta a demandas del ambiente. Regulación de genes ADAPTACION

FIN: Crecer y dejar descendencia La expresión de estos genes se lleva a cabo solamente cuando el microorganismos necesita las proteínas necesarias ligadas a los nutrimentos del ambiente. Para producir estas proteínas se necesita un alto grado de energía. Galletasa FIN: Crecer y dejar descendencia

Regulación de la expresión génica: Genes Constitutivos: Los que codifican para proteínas independientemente de las condiciones ambientales. Ejemplos: Genes para: RNA ribosómicos Proteínas ribosómicas RNA de transferencia RNA polimerasa Regulación de la expresión génica: Transcripción Tratamiento de mRNA Traducción Función enzimática 1) El de rápido encendido y apagado de la expresión de genes en respuesta a cambios ambientales. 2)Circuitos pre programados de expresión de genes

¿Cómo aprovechan los nutrientes? Las bacterias mejor adaptadas han sido capaces de crecer utilizando diferentes hidratos de carbono (glucosa, sacarosa, lactosa, arabinosa, galactosa)como fuente de energía. Glucosa Otros carbohidratos Lactosa Inducción Expresión de genes que codifican para degradar la lactosa. Glucolisis b-lactamasa

Genes para la uso de la lactosa como fuente de carbono b-galactosidasa : hidroliza a la lactosa para formar glucosa y galactosa. 4 subunidades idénticas de 1021 aminoácidos. b-galactosido permeasa: transporte de azucares. Bombea b-galactósidos al interior de la célula. 275 aminoácidos b-galactosido transacetilasa: acetila la glucosa transfiere un grupo acetilo desde el acetil-CoA a los b-galactosidos. 275 aminoácidos. La expresión de los genes requiere un alto grado de energía. ATP GTP

a nivel de transcripción. Es por ello que las bacterias han desarrollado mecanismo por los cuales la síntesis de estas enzimas que cataboliza la lactosa se enciende en presencia de esta y se apaga en ausencia de la misma. INDUCCIÓN: mecanismo por el cual la expresión de los genes se enciende por acción de una sustancia presente en el ambiente. (como la lactosa). Esas sustancias se llaman INDUCTORES y a los genes que cuya expresión se regula de este modo se llaman GENES INDUCIBLES. Las enzimas que intervienen en las vías catabólicas, en el caso de carbohidratos como la lactosa, galactosa y arabinosa son inducibles de manera característica: a nivel de transcripción.

¿y si hay nutrientes en el medio? Las bacterias posen la capacidad metabólica de sintetizar la mayoría de las moleculas orgánicas(aminoácidos, purinas ,vitaminas etc.) que requieren para crecer. Triptófano E. Coli tiene 5 genes que codifican para síntesis de triptófano Si hay nutrientes en el medio se “apagan” los genes que sintetizan el triptófano, a este proceso se llama REPRESIÓN. Un gen cuya expresión se ha apagado de esta forma se dice que se ha REPRIMIDO y cuando se enciende se ha DESREPRIMIDO.

Numero de proteínas enzimáticas Modelo del operón En 1965 F. Jacob y J. Monod se les otorgo el premio nobel por proponer el modelo del operón para explicar la regulación de genes que codifican a las enzimas para el catabolismo de la lactosa en E. coli. Operón: la unidad contigua completa incluyendo los genes estructurales, el operador y el promotor. Operón Numero de proteínas enzimáticas Función Lac 3 Hidrólisis y transporte de b-galactosidos. His 9 Síntesis de histidina Leu 4 Conversión del a-oxoisovaleriano a leucina ara Transporte y utilización de la arabinosa

Datos importantes sobre el operon lac El operon lac de E. coli es un operón inducible El gen regulador del operón de la lactosa, es lacI que codifica para la proteína represora, gen i. La forma activa del represor lac, es un tetrámero que contiene cuatro copias del producto génico i. Algunas pocas moléculas de los productos génicos de los genes del operón lac, se sintetizan en el estado no inducida proporcionando un nivel muy bajo de actividad enzimática El inductor del operón realmente es la alolactosa

¿Cuánto miden? 1045 pb 80 pb 35 pb 3510 pb 780 pb 825 pb Operón

Represión por catabolito (efecto glucosa) Control positivo del operón lac por CAP Y AMP cíclico Cuando hay glucosa y lactosa en el medio, E. coli solo ocupa la glucosa. ¿Qué le pasa al operón lac? Represión por catabolito (efecto glucosa) Sitio de unión CAP-cAMP Centro de entrada de la ARN Pol CAP Proteína activadora por catabolito cAMP

NIVELES ALTOS DE GLUCOSA Niveles altos de glucosa, producen niveles bajos de cAMP ARN Pol cAMP CAP Cuando existe gran cantidad de glucosa, la concentración de cAMP es muy baja y el complejo CAP-cAMP no se forma. Ello impide que la ARN Pol se una a su centro de entrada.

NIVELES BAJOS DE GLUCOSA Niveles bajos de glucosa, producen niveles altos de cAMP ARN Pol Cuando no hay glucosa disponible, se forma un complejo entre la CAP y el cAMP, que se enlaza a su sitio de unión en el promotor y permite que la ARN Pol se una a su sitio de entrada y hay transcripción de genes. cAMP CAP

Practica de laboratorio Objetivos - Comprender la importancia de la regulación genética como mecanismo para controlar los niveles de enzimas en la célula. Conocer los elementos que integran el operón de la lactosa. - Entender el funcionamiento del operón de la lactosa en presencia y ausencia de este carbohidrato. - Conocer el concepto de represión catabólica y cómo se lleva a cabo.

Material biológico Cultivo de E. coli W3110 en medio M9-glicerol. Reactivos − 1 tubo con medio M9-glicerol estéril − Solución de glucosa al 2% estéril − Solución de lactosa al 2% estéril − Solución de glucosa 2% + lactosa 2% estéril − Amortiguador Z (Na2HPO4-7H2O 60 mM, NaH2PO4-H2O 40 mM, KCl 10 mM, MgSO4-7H2O 1mM, β-mercaptoetanol 50 mM, pH 7.0). − Reactivo ONPG (Orto-Nitrofenil Galactosa). El reactivo es incoloro y debe prepararse justo antes de usarse para mejores resultados. − SDS al 0.1% − Na2CO3 1M − Cloroformo

ONPG (o-nitrophenyl galactoside) Sustrato de la -galactosidasa Si existe enzima en el medio, el ONP es utilizado Incoloro Amarillo

Análisis de la técnica: Explica que es lo que hace cada reactivo. En dónde se encuentran las enzimas que son inducidas por la lactosa, en donde vamos a añadir el reactivo que nos dice que las enzimas se sinterizaron?

¿ que resultados se esperan? +Lactosa Tubo A: Coloración amarilla débil ya que no hay lactosa en el medio (BASAL). Tubo B: Color amarillo mas intenso debido a que la lactosa es la única fuente de carbono (ENTONCES EL OPERÓN LAC SE ENCUENTRA INDUCIDO). Tubo C: Coloración amarilla intermedia debido a que primero se ocupo la glucosa y posteriormente la lactosa. Tubo D: Coloración amarilla intermedia debido a la represión catabólica por la glucosa, pero la posterior inducción por la presencia de lactosa, siempre y cuando la glucosa se acabe Tubo E: Sin Coloracion ya que no hay células en el medio.

Fuentes Lehninger Albert L., Principios de bioquímica, Editorial: ediciones omega, S.A., Barcelona, pp. 910-910 Gardner Eldon Jonh, Principios de genética, editorial Limusa Wiley, Mexico, 4ª edición, pp. 390-400 Devlin, Thomas M., Bioquímica, libro fe texto con aplicaciones clínicas, Editorial Reverte S.A., Mexico, 4ª edición. Alberts, Bray, Lewis et all, Biología molecular de la célula, Editorial ediciones Omega S.A. Barcelona, 2ª edición.