Bioquímica III Prof. Humberto González M. Regulación de la expresión génica Para que la información genética almacenada en el DNA sea utilizada por los organismos se requiere que sean sintetizadas cadenas de RNA complementarias al DNA por medio de un proceso conocido como transcripción (de “scribere”=escribir y “trans”= pasar de uno a otro, en este caso de una escritura a otra).

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Transcripción  Fue adoptado por la evolución para tener un mensajero capaz de llevar la información almacenada en el DNA de forma parcializada, ordenada y regulada.  El resultado de la transcripción es una molécula de RNA llamada transcrito.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Inicio

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Transcritos  Cuando sirve como patrón para la síntesis de proteínas se conoce como RNA mensajero o RNAm;  Cuando constituye parte de la estructura de los ribosomas, como RNA ribosomal o RNAr;  Cuando participa en la síntesis de proteínas como adaptador de los aminoácidos, como RNA de transferencia o RNAt; o  Puede tener varias otras actividades como enzimáticas, ribozima enzimáticas, ribozima o actividades de regulación de la expresión genética, RNA de interferencia o RNAi. o actividades de regulación de la expresión genética, RNA de interferencia o RNAi.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Transcripción y Superenrollamiento RNA polimerasa Burbuja de Transcripción Híbrido RNA-DNA EnrollamientoDesenrollamiento RNA 5' 3' 5' 3' Dirección de la trancripción 5' 3' 5' Superhélicesnegativas Superhélicespositivas (a) (b)

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Localización de transcritos DNADNA Transcritos de RNA 36 x 10 3 pb  Genoma de adenovirus, ambas hebras contienen codificación de proteínas. Muchos de los mensajeros se sintetizan inicialmente en forma de un transcrito largo que proviene de dos tercios de la longitud del DNA. Este transcrito es modificado posteriormente.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Nomenclatura de las hebras de DNA en la transcripción Hebra molde Hebra menos (-) Hebra codante Hebra molde Hebra menos (-) Hebra codante Hebra no molde Hebra más (+) Hebra no codante Hebra no molde Hebra más (+) Hebra no codante

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Ejemplo de complementariedad (5')CGCTATAGCTGTTT(3')(5')CGCTATAGCTGTTT(3') (3')GCGATATCGACAAA(5')(3')GCGATATCGACAAA(5') (5')CGCUAUAGCUGUUU(3')(5')CGCUAUAGCUGUUU(3') Hebra de DNA no molde (+) Hebra de DNA molde (-) Transcrito de RNA

Bioquímica III Prof. Humberto González M. RNA polimerasa Núcleo de la enzima Subunidad Subunidad 

Bioquímica III Prof. Humberto González M. RNA polymerase of E. coli is a multisubunit protein SubunitNumberRole  2 uncertain  2 uncertain  1 forms phosphodiester bonds  ’ 1 binds DNA template  1 recognizes promoter and  1 recognizes promoter and facilitates initiation facilitates initiation    ’     ’ +  holoenzyme core polymerase sigma factor Prokaryotic RNA polymerase structure

Bioquímica III Prof. Humberto González M. RNA synthesis usually initiated with ATP or GTP (the first nucleotide) RNA synthesis usually initiated with ATP or GTP (the first nucleotide) RNA chains are synthesized in a 5’ to 3’ direction RNA chains are synthesized in a 5’ to 3’ direction Termination of some transcripts makes use of the Rho protein, which is a Termination of some transcripts makes use of the Rho protein, which is a termination factor that catalyzes the dissociation of the RNA and polymerase termination factor that catalyzes the dissociation of the RNA and polymerase A = T U = A A = T U = A RNA Mechanism of RNA synthesis

Bioquímica III Prof. Humberto González M.  the sigma subunit of RNA polymerase is an “initiation factor”  there are several different sigma factors in E. coli that are specific for different sets of genes  sigma factor functions to ensure that RNA polymerase binds stably to DNA only at promoters sigma destablizes nonspecific binding to non-promoter DNA sigma destablizes nonspecific binding to non-promoter DNA sigma stabilizes specific binding to promoter DNA sigma stabilizes specific binding to promoter DNA this accelerates the search for promoter DNA this accelerates the search for promoter DNA The function of sigma factor

Bioquímica III Prof. Humberto González M. The function of sigma factor K a (M -1 ) K a (M -1 ) Any DNAPromoter DNA Any DNAPromoter DNA (nonspecific) (specific) Core 2 X Holo 1 X to promoters vary in “strength” by ~two orders of magnitude promoters vary in “strength” by ~two orders of magnitude

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Promotores de E. coli. 1

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Promotores en E. coli. Resumen Región -35 Espaciador Región -10 Espaciador Inicio del RNA TTGACA N 17 TTAACT N7N7N7N7A TTTACA N 16 TATGAT N7N7N7N7A TTTACA N 17 TATGTT N6N6N6N6A TTGATA N 16 TATAAT N7N7N7N7A CTGACG N 18 TACTGT N6N6N6N6A TTGACATATAAT trp tRNA Tyr lac recA araB, A, D

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Promotor de E. coli

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Promotores en E. coli con regulación lejana

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Inhibidores de la transcripción +NH+NH SarSarL-ProL-Pro L-meValL-meVal D-ValD-Val L-ThrL-Thr OOSarSarL-ProL-Pro L-meValL-meVal D-ValD-Val L-ThrL-Thr OO OO OO CC CC NN NH 2 OO OO CH 3 Acridina Actinomicina D

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Terminación de la transcripción  Una vez que el proceso de transcripción ha comenzado la burbuja de transcripción avanza a medida que el RNA es transcrito y se continúa hasta que la polimerasa encuentra una secuencia que induce la disociación del complejo DNA-RNA y la separación de la enzima.  En eucariontes esta secuencia no ha sido bien estudiada, mientras que para los procariontes como E. coli se han reconocido dos tipos de señales de terminación que se diferencian por la ausencia o presencia de un factor proteico que parece reconocer dicha señal.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Terminación rho independiente  Terminación independiente de rho (  ), contiene una secuencia que induce a la formación de una horquilla en el transcrito de RNA de 10 a 15 nucleótidos antes del final, seguida por un tramo de poliA en la cadena molde que facilita la disociación de los elementos de la transcripción.

Bioquímica III Prof. Humberto González M.  En la terminación dependiente de  no se presenta el tramo de poliA, aunque sí se forma una horquilla en la que la RNA polimerasa hace una pausa y si se encuentra la proteína  presente se detiene la transcripción.  No se conoce a detalle el mecanismo de disociación, pero en este se produce la hidrólisis de ATP por efecto de .

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Acoplamiento entre trascripción y traducción DNA duplex 5' 3' 5' 3' RNA polimerasa NH 3 + Dirección de traducción Dirección de transcripción Ribosoma mRNA 5' mRNA

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Elementos reguladores lejanos en operones bacterianos

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Regulación de la transcripción en procariontes.  Muchas proteínas bacterias son inducibles su síntesis es regulada dependiendo del estado nutricional de la célula. su síntesis es regulada dependiendo del estado nutricional de la célula.  La expresión diferencial de los genes que codifican para esas proteínas esta regulada generalmente a nivel de la iniciación de la transcripción

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Regulación negativa en la transcripción OperadorOperador DNADNA PromotorPromotor mRNAmRNA 5'5' 3'3' mRNAmRNA 5'5' 3'3' (a) La molécula señal ( ) origina la disociación de la proteína reguladora del DNA (a) La molécula señal ( ) origina la disociación de la proteína reguladora del DNA (b) La molécula señal ( ) origina la unión de la proteína reguladora al DNA (b) La molécula señal ( ) origina la unión de la proteína reguladora al DNA

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Regulación positiva en la transcripción mRNAmRNA 5'5' 3'3' mRNAmRNA 5'5' 3'3' RNA polimerasa (a) La molécula señal ( ) origina la disociación de la proteína reguladora del DNA (a) La molécula señal ( ) origina la disociación de la proteína reguladora del DNA (b) La molécula señal ( ) origina la unión de la proteína reguladora al DNA (b) La molécula señal ( ) origina la unión de la proteína reguladora al DNA

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Modelo general de operón DNADNA Sitio de unión del activador Sitio de unión del activador PromotorPromotor Sitio de unión del represor (operador) Sitio de unión del represor (operador) Secuencias reguladoras ABC

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Operón lac  Jacob y Monod describieron el control transcripcional del operón de lactosa, que codifica 3 proteínas inducibles.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Operón lac  Es reprimido por unión de la proteína represora de lac a la secuencia operadora.  En presencia de lactosa o otros inductores, esta represión se levanta y el operón lac se transcribe.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Operón lac reprimido mRNAmRNA PIPIPIPIIZ YA PPOO RepresorRepresor

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Mutaciones del promotor o el operador  Las mutaciones en el promotor, o en el operador, actúan en cis; esto es sólo afectan la expresión de los genes en la misma molécula de DNA en que ocurre la mutación.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Las mutaciones Oc del Operón lac actúan en cis

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Mutaciones constitutivas  Las mutaciones en la secuencia de un operador que resulta en la disminución de la unión del represor, resultan en una transcripción constitutiva.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Mutaciones  Las mutaciones en una secuencia promotora, que afectan la afinidad de la unión de la RNA polimerasa pueden disminuir (mutación negativa) o incrementar (mutación positiva) la transcripción.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Regulación en trans  Los represores y los activadores actúan en trans; esto es, afectan a la expresión de los genes que regulan sin importar en qué molécula de DNA están localizados en la célula.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Acción trans del Operón lac

Bioquímica III Prof. Humberto González M. El inductor produce incremento en la transcripción del operón.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. X-Gal  5-bromo-4-chloro-3-indolyl-  - D-galactoside

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Inducción del operón lac PIPIPIPIIZ YA PPOO PIPIPIPIIZ YA PPOO DNADNA mRNAmRNA Alolactosa (o IPTG) Alolactosa

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Activación de la transcripción del operón lac 5'-ATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCA5'-ATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCA GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG GAATTGTGAGCGTGATAACAATTTCACACGAATTGTGAGCGTGATAACAATTTCACAC Sitio CAP Región -35 Región -10 Operador Sitio de unión a la RNA polimerasa

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Estructura tridimensional del homodímero CAP DNADNA Motivo de unión al DNA cAMPcAMP

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Control positivo de la transcripción  Una proteína reguladora promueve la unión de la RNA polimerasa, de manera que se incrementa la síntesis del mRNA.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Efectos combinados de glucosa y lactosa en la expresión del operón lac PPOO PPOO PPOO PPOO Deficiencia de glucosa, abundancia de cAMP Deficiencia de glucosa, abundancia de cAMP Abundancia de glucosa, deficiencia de cAMP Abundancia de glucosa, deficiencia de cAMP Deficiencia de lactosa Abundancia de lactosa RNA polimerasa mRNA

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Operón ara araC araB araA araD Genes estructurales Sitios de Regulación araO 2 araO 1 araI PCPCPCPC PCPCPCPC P BAD Sitio de unión de CAP araC mRNA Represor Activador L -Arabinosa araBAD mRNA

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Regulación del operón ara (1) araC araO 2 araO 1 PCPCPCPC PCPCPCPC araI Sitio de unión de CAP P BAD araBAD RNApolimerasaRNApolimerasa araC mRNA

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Regulación del operón ara (2) araO 2 araC araO 1 araI araBAD P BAD PCPCPCPC PCPCPCPC ProteínasAraCProteínasAraC Sitio de unión de CAP Glucosa a niveles altos arabinosa a niveles bajos Glucosa a niveles altos arabinosa a niveles bajos

Bioquímica III Prof. Humberto González M. araC araO 2 PCPCPCPC PCPCPCPC araI P BAD araBAD RNApolimerasaRNApolimerasa araBAD mRNA CAP-cAMPCAP-cAMP Glucosa a niveles bajos arabinosa a niveles altos Glucosa a niveles bajos arabinosa a niveles altos arabinosaarabinosa Proteína AraC Regulación del operón ara (3)

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Operón de triptofano Trp RepresorTrp P O trpR Guía (trpL) Atenuador trpE trpD trpC trpB trpA RepresormRNA Región reguladora Genes estructurales mRNAatenuado altos niveles de triptofano trp mRNA bajos niveles de triptofano

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Regulación del operón trp 5' mRNA Péptidolíder MKAIFVLKGWWRTS Ribosoma Estructuraatenuadora RNApolimerasa DNA Codones Trp UUU 3' Péptidolíder Genes estructurales DNA RNApolimerasa MKAIFVLKG

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Secuencia guía de trpL Péptido guía M K A I F V L K G W W R T S - PARO PolipéptidoTrpEPolipéptidoTrpE

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Apareamiento del atenuador Par 3:4 Par 2:3

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Otros mecanismos de atenuación  Las Bacteria Gram positivas (B. subtilis) utilizan la atenuación.  El mecanismo es independiente de la traducción.  Utiliza una proteína que se une al RNA cuando existe un efector.  El efector puede ser el aminoácido regulado pero también su aminoacil-tRNA.  La proteína se llama proteína trp de atenuación (en el caso del triptofano).

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Otros sistemas de atenuación  Operones de la biosíntesis de pirimidinas (E. coli traduccional y B. subtilis con proteína de atenuación).  Atenuación traduccional. La traducción del péptido líder previene la traducción del siguiente gen en un mensajero policistrónico.  Genes de resistencia a antibióticos en Gram positivas.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Redes de control global  Sistemas que regulan muchos genes simultáneamente en respuesta a una señal ambiental específica.  Los sistemas de control global pueden incluir más de un regulón.  Modulón es un grupo de genes que pueden responder a una proteína reguladora común incluso cuando son de diferentes regulones.  Estimulón es un grupo de genes que responden a la misma señal ambiental

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Factores sigma alternativos  Factor sigma es la subunidad de la RNA polimerasa que reconoce al promotor.  La mayoría de genes de E. coli responden a  70.  La cantidad del factor sigma alternativo regula la respuesta del E. coli sistema global.  En E. coli hay 7 factores  diferentes.  B. subtilis tiene un factor  más.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. DNA RepressorRepressor + Inducer DNA RepressorRepressor + Inducer lac operator 2 X X All other DNA 2 X X 10 6 ___________________________________________________ Specificity ___________________________________________________ 1 Specificity is the ratio of (K a for binding to operator DNA) / (K a for binding to random DNA) (K a for binding to operator DNA) / (K a for binding to random DNA) Affinity of lac repressor for DNA (M -1 )

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Algunos sistemas de control global en Escherichia coli.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Quorum sensing (percepción del quorum)  Señal regulatoria controlada por la densidad de población.  Cada bacteria sintetiza una lactona de homoserina acilada (AHL).  La AHL difunde hacia el exterior de la célula sin problema.  Se alcanza un concentración intracelular alta de AHL cuando hay alta densidad celular.  AHL se une a una proteína activadora y enciende genes.  Sistema luciferasa bacteriana, genes de producción de biofilms (películas) en P. aeruginosa, en Staphylococcus aureus produce varias proteínas virulentas.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Transducción de señales y sistemas reguladores de dos componentes  La señal externa no es transmitida directamente a la proteína reguladora.  La señal es detectada primero por un sensor  La señal se transmite en una forma diferente hacia el sistema regulador en un proceso llamado transducción de señales.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Componentes del sistema regulador  Proteína detectora específica localizada en la membrana. Generalmente una quinasa detectora.  Proteína reguladora de respuesta específica.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Quinasa detectora  Enzima de membrana plamática que Fosforila compuestos  Detecta la señal ambiental en la superficie externa y se fosforila a sí misma en un residuo de histidina  Este fosfato se transmite a el regulador de respuesta intracelular.  El regulador de respuesta intracelular es una proteína que controla la trascripción uniéndose al DNA.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Sistemas reguladores de dos componentes en la regulación de la transcripción de E. coli

Bioquímica III Prof. Humberto González M.  fin

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Quimiotaxis  Movimiento de acercamiento o alejamiento bacteriano de un compuesto químico particular  No es una respuesta a gradientes espaciales de una sustancia sino gradientes temporales Sienten el cambio en concentración de un compuesto fuera de la célula a intervalos Sienten el cambio en concentración de un compuesto fuera de la célula a intervalos  Sistema de dos componentes para sentir este cambio y regulan el movimiento flagelar.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Proteínas involucradas en quimiotaxis  Proteínas sensoras: Aceptoras de grupos metilo (MCPs)  En E. coli se han identificado cinco MCPs  Todas son transmemebranales  Las MCPs se unen directamente a un compuesto o indirectamente a una proteína periplasmática  Se disparan una serie de reacciones que afectan la rotación del flagelo. Rotación antihorario, la célula continua, rotación horario, la bacteria da un viraje. Rotación antihorario, la célula continua, rotación horario, la bacteria da un viraje.

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Quimiotáxis en E. coli  CheW y CheA proteínas citoplásmicas,

Bioquímica III Prof. Humberto González M.  La mayoría de sistemas de regulación controlan la transcripción mediante proteínas reguladoras.  Existen RNAs reguladores (antisentido)

Bioquímica III Prof. Humberto González M. <

Bioquímica III Prof. Humberto González M. Resumen de la transcripción