RED DE BIODEGRADACIÓN DE LIGNINA Y HEMICELULOSA “ Estudio comparativo de la acción de mediadores redox de lacasa en la transformación de ligninas” K. González Arzola a, M.C. Arévalo b, M.A. Falcón a a. Departamento de Microbiología y Biología Celular, Universidad de La Laguna, Tenerife. b. Departamento de Química Física, Universidad de La Laguna, Tenerife.

OBJETIVOS Caracterización electroquímica de los mediadores redox Desarrollo de sistemas acuosos lacasa-mediador para la transformación de ligninas Estudio de las transformaciones mediante técnicas cromatográficas, espectrofotométricas y electroquímicas

1-Hidroxibenzotriazol (HBT) Mediadores 2,2’-azino-bis-3- etilbenzotiazolin -6-ácido sulfónico (ABTS) Ácido violúrico (VA) 1-Hidroxibenzotriazol (HBT)

Ligninas Lignina de Kraft (Indulina AT, Westvaco): KL Lignina Björkman de pino: PL

Sistema Lacasa-mediador (LMSs) Componentes 1 mg Lignina (KL o PL) en 5 mM NaOH 0.2 U Lacasa en Tampón Mc Ilvaine 0,1 M pH 6 1 mM ABTS 10 mM VA 1 mM HBT 37ºC 1400 rpm

Después de 48 h de incubación: Espectrofotometría UV-Vis Cromatografía de Exclusión molecular (SE) en HPLC

Cromatografía de exclusión molecular en HPLC Aliquat 336 20 mM en Tetrahidrofurano Bomba binaria Waters 1525 Inyector automático Columnas GHXL HXL 3000 HXL 4000 Fotodiodo Array Perfiles de MM Espectros UV-Vis

Electrodo de trabajo (grafito) Voltametría Cíclica Electrodo de trabajo (grafito) Contraelectrodo (Pt) Electrodo de ref. (ECS) Mediadores 0,2 mM Ligninas 0,2 mg/ml Velocidad 5 mV/s 37ºC Citrato sódico pH 6 37ºC Potenciostato- galvanostato Ciclovoltagramas

Voltametría Cíclica: ABTS PL + ABTS KL + ABTS Potencial (V) 0.2 0.6 1 0.8 0.4 9 14 -1 4 19 0.2 0.6 1 0.8 0.4 7 11 -1 3 15 Potencial (V) ABTS2+ E0’ 854 mV ABTS·+ E0’ 440 mV ABTS ABTS PL KL

Voltametría Cíclica: VA KL + VA PL + VA Potencial (V) 0.2 0.6 1 0.8 0.4 2.8 4.8 -1.2 6.8 Potencial (V) 0.2 0.6 1 0.8 0.4 4 7 -2 10 E0’ 632 mV PL KL VA VA

Voltametría Cíclica: HBT E0’~ 840 mV KL + HBT Potencial (V) 0.2 0.6 1 0.8 0.4 5 7.5 2.5 10 Potencial (V) 0.2 0.6 1 0.8 0.4 4 6 2 8 PL + HBT HBT HBT PL KL

Cromatografía SE : ABTS KL PL 87 kDa 0,8 kDa 87 kDa 0,8 kDa 10 20 30 40 50 60 70 0.03 0.06 0.09 0.12 Tiempo (min) 0.0125 0.025 0.0375 0.05 Tiempo (min) 10 20 30 40 50 60 70 Lac activa Lac activa Control Control

Espectrofotometría UV- VIS nm 230 240 260 270 280 300 340 395 KL ABTS (66 min) 62.4 160.9 89.9 658.9 58.5 166.4 113.2 7.7 VA (32 min) 4.6 3.1 3.6 3.5 3.4 3.7 4.0 4.7 HBT 1.4 1.5 1.6 1.7 1.3 PL (46 min) 16.9 17.4 12.2 13.5 14.1 22.7 203.2 4.2 (26 min) 23.6 30.2 19.9 6.7 4.8 3.9 (24 min) 0.9 4.1 4.3 2.8 2.7 3.3 89.9 658.9 113.2

Cromatografía SE : VA KL PL Lac activa Lac activa Control Control 400 kDa 5,6 kDa 400 kDa 5,6 kDa Tiempo (min) 0.03 0.06 0.09 0.12 10 20 30 40 50 60 70 Tiempo (min) 0.015 0.03 0.045 0.06 10 20 30 40 50 60 70 Lac activa Lac activa Control Control

Cromatografía SE : HBT KL PL Control Control Lac activa Lac activa 400 kDa 5,6 kDa 400 kDa 5,6 kDa Tiempo (min) 0.12 0.24 0.36 0.48 10 20 30 40 50 60 70 Tiempo (min) 0.045 0.09 0.135 0.18 10 20 30 40 50 60 70 Control Control Lac activa Lac activa

Los mediadores HBT y VA inactivan a las lacasas (Li et al. 1999). La estabilidad de los sistemas lacasa-mediador se incrementa en presencia de las ligninas. Por tanto, la gran despolimerización detectada podría deberse a este efecto.

CONCLUSIONES Los estudios electroquímicos revelaron que el ABTS presentó los mejores resultados catalíticos. El radical ABTS.+ oxidó la KL con mayor intensidad, mientras que el dicatión ABTS2+ catalizó mejor a la PL. 2. El sistema lacasa-ABTS despolimerizó ambas ligninas, despolimerización que resultó más importante para la PL. 3. Los sistemas constituidos por los mediadores N-OH (VA y HBT) polimerizaron ambas ligninas. Esta polimerización fue más intensa que con lacasa sola, lo que se podría atribuir parcialmente a la mayor estabilidad en presencia de estos mediadores y de ligninas.