Enzimas

Conceptos básicos ¿Qué son las enzimas? ¿Qué parte de las enzimas es la responsable de su especificidad de sustrato? ¿Sobre qué base se da a las enzimas sus nombres particulares? Formas en que las enzimas rompen enlaces

Las enzimas son proteínas que catalizan las reacciones bioquímicas. Existen en muy bajas concentraciones en la célula. Aumentan la velocidad de reacción sin alterar el equilibrio.

Estructura 3aria o 4aria  Función biológica Cadenas laterales de aa en el sitio activo Existen cinco cadenas laterales

Importancia de las enzimas Diagnóstico de muchas enferme-dades. Muchas fármacos son inhibidores de la actividad enzimática Industria de alimentación y agri-cultura.

Intervienen en una gran cantidad de reacciones del metabolismo de células, tejidos y órganos Catalizan reacciones químicas necesarias para la sobrevivencia celular: metabolismo de los hidratos de carbono, proteínas, aa, lípidos, ácidos nucleicos, etc. Las enzimas pueden actuar dentro de la célula, fuera de ésta y en el tubo de ensayo

Características de las Enzimas Las enzimas son CATALIZADORES ORGANICOS Un catalizador aumenta la velocidad de reacción química Las reacciones químicas requieren de energía externa para ocurrir Esta energía externa se llama ENERGIA DE ACTIVACIÓN

Tiempo de la reacción E + S E + P Sin enzima Con enzima La Ea de la hidrólisis de la urea baja de 30 a 11 kcal/mol con la acción de las enzimas, acelerando la reacción 1014 x El aumento de temperatura necesario para producir la reacción no catalizada seria de 529ºC

Las enzimas catalizan la reacción bajando la energía requerida para pasar de sustrato a producto REACCION NO CATALIZADA El agua no es capaz de pasar sobre la montaña REACCION CATALIZADA: Las olas pasan sobre la montaña ENERGIA DE ACTIVACIÓN 03_15_Enzymes catalyze.jpg

Algunos aumentos de actividad producidos por el uso de enzimas Clase 10 10

Enzima vs Catalizador Tanto la enzima como el catalizador aceleran la velocidad de una reacción química. Una enzima puede transformar 1000 moléculas de sustrato/ segundo Las enzimas tienen 3 propiedades que los catalizadores NO tienen: Especificidad por el sustrato Se inactivan por desnaturación Pueden ser reguladas Clase 11 11

Clasificación de las enzimas Comisión de Enzimas (EC) de la IUPAC Se basa en el tipo de reacción que catalizan Comprende cuatro dígitos y un nombre complejo

Tipo de reacción catalizada ATP: hexosa fosfotransferasa Nombre sistemático: Donador Aceptor Grupo transferido Tipo de reacción catalizada EC 2.7.1.1 Número EC Enzyme Comission Grupo Subgrupo Nombre común (sustrato+”asa”): Hexokinasa

Clasificación de enzimas por Grupos EC 1.x  Oxidorreductasas EC 2.x  Transferasas EC 3.x  Hidrolasas EC 4.x  Liasas EC 5.x  Isomerasas EC 6.x  Ligasas

Grupo 1: Oxidorreductasas Catalizan reacciones de oxidorreducción, en que átomos de oxigeno ó hidrogeno son trasladados entre moléculas: AH2 + B A + BH2 Ared + Box Aox + Bred En las reacciones redox, siempre tienen que estar presentes a la vez el aceptor y el dador electrónico.

Nomenclatura del subgrupo en oxidorreductasas: EC 1.1.x - Deshidrogenasas EC 1.2.x - Oxidasas EC 1.3.x - Peroxidasas EC 1.4.x - Oxigenasas EC 1.5.x - Hidroxilasas EC 1.6.x - Reductasas etc. Aplicaciones: Ensayos de diagnostico clínico (glucosa oxidasa y colesterol oxidasa Deslignificación ó Bioblanqueamiento

Grupo 2: Transferasas A + B-X A-X + B Catalizan reacciones de transferencia de átomos ó grupo de átomos entre moléculas: A-X + B A + B-X Dador: Aceptor Grupo transferido - transferasa ATP: D-Hexosa Fosfotransferasa EC 2.7.1.1 Nombre común: hexokinasa

Clasificación de subgrupo de las transferasas: EC 2.1.x - Grupos monocarbonados EC 2.2.x - Grupos aldehido o ceto EC 2.3.x - Aciltransferasas EC 2.4.x - Glicosiltransferasas EC 2.5.x - Alquil- o Ariltransferasas EC 2.6.x - Grupos nitrogenados EC 2.7.x - Grupos fosfato EC 2.8.x - Grupos sulfato EC 2.9.x - Grupos selenio Aplicaciones: Síntesis de oligosacáridos

Grupo 3: Hidrolasas A-B + H2O A-OH + H-B Catalizan reacciones de hidrólisis y también su reverso. Son las más comunes en el dominio de la tecnología enzimática: A-B + H2O A-OH + H-B No se suelen utilizar nombres sistemáticos en las hidrolasas. Muchas de ellas conservan el nombre Primitivo. Ejemplo: Quimosina EC 3.4.23.4.

Clasificación de las hidrolasas: 3.1.-.- Esterasas (carboxilesterasas, fosfoesterasas, sulfoesterasas) 3.2.-.- Glicosidasas 3.3.-.- Éter hidrolasas 3.4.-.- Péptido hidrolasas 3.5.-.- Acil anhídrido hidrolasas etc. Aplicaciones: Lipasas → Síntesis de tensioactivos Proteasas → Fabrico de quesos Glicosidasas → Clarificación de jugos; liberación de aromas en los vinos; aplicaciones textiles

Caso particular  Péptido hidrolasas: clasificación común (no Caso particular  Péptido hidrolasas: clasificación común (no sistemática) I. Según la situación del enlace atacado: - Exopeptidasas (extremos de la cadena) (Peptidasas) - Endopeptidasas (interior de la cadena) (Proteinasas) II. Según el mecanismo catalítico: - Serin proteinasas - Tiol proteinasas - Aspartil proteinasas - Metaloproteinasas

Grupo 4: Liasas Catalizan reacciones reversibles de remoción de grupo de átomos del sustrato (este grupo no incluye las hidrolasas): A-B A + B Ejemplo Nombre sistemático: Histidina amonio-liasa (EC 4.3.1.3) Nombre común: Histidasa

Clasificación de las liasas: 4.1.x - Actúan sobre enlaces C-C 4.2.x - Actúan sobre enlaces C-O 4.3.x - Actúan sobre enlaces C-N 4.4.x - Actúan sobre enlaces C-S 4.5.x - Actúan sobre enlaces C-Haluro (S-, Cl-, Br-, I- At-) 4.6.x - Actúan sobre enlaces P-O 4.99.x - Otras liases Aplicaciones: Pectato liasa – Remueve los compuestos indeseables (ceras, pectinas, proteínas) en fibras en la industria textil – “bioscouring”

Grupo 5: Isomerasas Catalizan reacciones de isomerización moleculares A B Ejemplo: Glucosa isomerasa (EC 5.3.1.5)

Clasificación de las isomerasas: 5.1.x - Rasemasas y Epimerasas 5.2.x - cis-Trans-Isomerasas 5.3.x - Oxidoreductasas Intramolecular 5.4.x - Transferasas Intramoleculares (mutasas) 5.5.x - Liasas Intramoleculares 5.99.x - Otras Isomerasas

Grupo 6: Ligasas A + B + ATP A-B + ADP + Pi Catalizan la unión de dos grupos químicos a expensas de la hidrólisis de un nucleótido trifosfato (ATP, GTP, etc.). A + B + ATP A-B + ADP + Pi Ejemplo: Glutationa sintasa (EC 6.2.2.3) Nombre sistémico: G-L-glutamilo-L-cisteina:glicina ligase

Clasificación de las ligasas: 6.1.x - Forman enlaces C-O 6.2.x - Forman enlaces C-S 6.3.x - Forman enlaces C-N 6.4.x - Forman enlaces C-C 6.5.x - Forman enlaces ésteres fosfóricos 6.6.x - Actúan sobre enlaces N-metal

Cinética de las reacciones enzimáticas

Cinética Enzimática La cinética enzimática es el análisis cuantitativo del efecto de cada uno de los factores que intervienen en la actividad enzimática, que se evalúa a través de la velocidad de la reacción catalizada. Las variables más importantes son: Concentración de enzima, sustratos y productos (incluyendo inhibidores y/o activadores) pH Temperatura

Las enzimas se unen a los reactivos (sustratos) Cada enzima tiene una forma única con un sitio o centro activo en el que se une al sustrato Después de la reacción, enzimas y productos se separan. Las moléculas enzimáticas no han cambiado después de participar en la reacción Clase 30 30 30

La unión del sustrato es muy específica: Complementariedad geométrica Complementariedad de cargas, uniones iónicas Llave – cerradura. Encaje inducido Modelos: Clase 31 31 31

Complejo Substrato+Enzima Modelo de Llave y Cerradura (Emil Fischer) Substrato y enzima se acoplan de forma estereospecífica, de la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura. Modelo aceptado durante mucho tiempo; hoy se considera insuficiente al no explicar algunos fenómenos de la inhibi- ción enzimática Substrato Enzima Complejo Substrato+Enzima Clase 32 32 32

Complejo Substrato+Enzima Modelo de Ajuste Inducido (Koshland) Tanto la enzima como el substrato sufren una alteración en su estructura por el hecho físico de la unión. Está mucho más de acuerdo con todos los datos experimen- tales conocidos hasta el momento. Substrato Enzima Complejo Substrato+Enzima Clase 33 33 33

Una enzima puede unir más de un sustrato en su sitio activo Enzima + sustratos Una enzima puede unir más de un sustrato en su sitio activo ADP + PEP ATP + PIRUVATO COMPLEJO ENZIMA-SUSTRATO Enzima + productos 34

Sustrato(s) Producto(p) Medición de la velocidad de reacción enzimática Enzima Sustrato(s) Producto(p)

Baja concentración de sustrato ALTA concentración de sustrato SATURACION 36

. . . Efecto de la concentración de substrato . . v . . . [s] 37

dt t s p [ ] d[P] v = , t 0 38

Hay un número limitado de sitios en la enzima Una cinética hiperbólica implica un proceso saturante: Hay un número limitado de sitios en la enzima para fijar substrato; una vez que están ocupados todos, por mucho que aumente la concentración de substrato, la velocidad permanecerá constante tendiendo a un valor asintótico 39

El sistema de ecuaciones diferenciales que describe la dinámica del sistema k+1 k+2 E + S ES E + P k-1 Sistema No admite solución analítica. - Simulaciones numéricas - Hipótesis que lo simplifiquen (Michaelis-Menten) 40

Hipótesis de Michaelis – Menten (equilibrio rápido) E + P k+1 k-1 k+2 E + S ES k+1 k-1 ES E + P k+2 41

Hipótesis de Michaelis-Menten 42

Hipótesis de estado estacionario Variación de complejo [ES] es prácticamente igual a cero dx/dt = k+1es - (k-1 + k+2) x = 0 43

Vmax * s v = Km + s Michaelis-Menten y Estado estacionario La única diferencia radica en el significado de Km: Km = k-1/k+1 en mecanismo de M.M. Km = (k-1 + k+2)/k+1 en mecanismo de E.E. 44

Significado de la constante Km 1. Constante de equilibrio de disociación del complejo ES (en condiciones de equilibrio rápido) 2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el substrato 3. Mide la función de fijación (en cond.de equilibrio rápido) 4. Concentración de substrato para la que la velocidad se hace igual a la mitad de la máxima (s0.5) 5. Se define para una pareja enzima-substrato 6. Se mide en unidades de concentración 45

Significado de la constante Vmax = k+2 e0 1. Velocidad asintótica para s 2. Directamente proporcional a la concentración de enzima (hoy se prefiere caracterizar a la enzima por k+2) 3. Mide función de transformación catalítica 4. Se expresa en unidades de velocidad 46

Relación entre Km y Vmax Michaelis y Menten Concentración de Sustrato [S] Velocidad de la reacción (v) Km Vmax Vmax/2 03_25_enzyme’s performance.jpg 47

A mayor Km, menor es la afinidad de la enzima por el sustrato Concentración de Sustrato [S] Velocidad de la reacción (v) Km Vmax Vmax/2 03_25_enzyme’s performance.jpg A mayor Km, menor es la afinidad de la enzima por el sustrato A menor Km mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato 48

49

Vmax Km 50

1/Vmax -1/Km 51

1/Vmax -Km 52

Vmax -Km 53

Métodos de linealización para determinación parámetros cinéticos Eje Y Eje X Intercepto Eje x Pendiente Lineweaver-Burke 1/v 1/s 1/V -1/K K/V Hanes s/v s -K Eadie-Hofstee v v/s V V/K

Actividad Enzimática

Así esta actividad corresponde al máximo potencial catalítico que las enzimas poseen para un determinado conjunto de condiciones ambientales. Existen situaciones (sustratos heterogéneos) donde la velocidad inicial de reacción no es representativa del real potencial catalítico de la enzima. Se asume que la velocidad inicial de reacción es proporcional a la concentración de proteína enzimática.

Actividad enzimática: Es el número de moles de sustrato que reaccionan para formar producto, por mol de enzima y por unidad de tiempo. Esto supone que la enzima está plenamente saturada con sustrato y por tanto la reacción se efectúa con su máxima rapidez Índice de recambio: muestra la eficiencia de la catálisis enzimática

Cálculo de Actividad Enzimática La velocidad de reacción catalizada por 0,1ml de una dilución 1:100 de Fosfatasa Alcalina es 0,3umoles / min. de producto. ¿Cuál es su actividad enzimática? 0,1ml-------- 0,3umoles producto / min. 1,0ml------------3,0umoles producto / min. dil 1:100-------------300umoles producto / min. Respuesta: 300U/ml

Número o Índice de Recambio Es útil definir una constante de velocidad más general, k cat , para describir la velocidad limitante de cualquier reacción enzimática a saturación kcat x Et= Vmáx V0 = k cat x Et x [S] / KM + [S]; Kcat es una constante de velocidad de 1er orden con unidades de tiempo-1, también llamada Número de Recambio

Efecto del pH 1. Sobre la fijación del substrato al centro activo: - Grupos disociables de la enzima - Grupos disociables del sustrato 2. Sobre la transformación catalítica del sustrato 3. Sobre la estructura de la proteína enzimática 60

Efecto del pH en la ENZIMA Cada enzima tiene un pH óptimo para su actividad El pH afecta las interacciones iónicas 61

Efecto de la temperatura 1. Aceleración de la reacción según la ecuación de Arrhenius k = A exp (-Ea/RT) 2. Desnaturalización térmica de la proteína 62

Efecto de la temperatura en la ENZIMA Aumento de la velocidad Desnaturación por calor 15º 40º 75º Temperatura Cada enzima tiene una temperatura óptima. 63

ORGANISMOS TERMÓFILOS Son organismos que viven a altas tº y realizan sus reacciones enzimáticas a estas altas tº Ejemplos son los que viven en las aguas termales Es tema de investigación el aislamiento de las enzimas de estos organismos para desarrollar procesos industriales en condiciones más extremas

Coenzimas-Cofactores Las coenzimas son pequeñas moléculas orgánicas, que se unen a la enzima. Las coenzimas colaboran en la reacción enzimática recibiendo transitoriamente algún grupo químico: H+ , OH, CH3 . La enzima sin la coenzima recibe el nombre de APOENZIMA 65

El NAD es una coenzima aceptora de H Sustrato oxidado 66

Algunas enzimas requieren metales para mejorar su actividad 67

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Isoenzimas o Isozimas Son formas moleculares diferentes de una misma enzima Catalizan la misma reacción Ejemplo: Lactato deshidrogenasa Lactato + NAD ==== Piruvato + NADH M4, M3H1, M2H2, M1H3 y H4 Se diferencian por su movilidad electroforética Usadas en clínica: sueros normales y sueros con alguna patología

Inhibición enzimática

Inhibidor: Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través de interacciones con el centro activo u otros centros específicos (alostéricos). Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan a la enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores: I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activo II. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la molécula, causando un cambio conformacional con repercusión negativa en la actividad enzimática.

Los inhibidores isostéricos pueden ser de dos tipos: 1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos: E + I EI ES + I ESI 2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima: E + I E’

Inhibición reversible (a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijación del substrato: Inhibición Competitiva (b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la fijación del substrato a la enzima, pero sí impide la acción catalítica: Inhibición No Competitiva (c) El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-substrato una vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipo se conoce como Inhibición Anticompetitiva

Inhibidores Competitivos Compiten con el sustrato por el sitio activo de la enzima Se une solo a la enzima libre V máx no se altera y K M cambia

E ES EI I S E + P Inhibición Competitiva Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas; el complejo EI no es productivo

Inhibición competitiva Al aumentar la cantidad de SUSTRATO el inhibidor competitivo es desplazado y se forma producto

Inhibidor competitivo Este inhibidor compite con el sustrato por el sitio activo de la enzima

Inhibidor competitivo su estructura es similar a la del sustrato No se forma producto

Inhibición Competitiva S ES E + P I Se define una constante de equilibrio de disociación del inhibidor: [E] [I] Ki = [EI] EI Características: - Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas - A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibición - Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del substrato. - El inhibidor es tan específico como el substrato

En condiciones de equilibrio rápido, llamando y a la concentración del complejo EI, para la inhibición competitiva obtenemos el siste- ma de ecuaciones De donde Que resuelto para x nos da

Por tanto, en la inhibición competitiva, 1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki) 2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor 3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potencia del inhibidor competitivo.

Inhibidor competitivo Sin inhibidor Con inhibidor El inhibidor competitivo aumenta la Km Km Sin inhibidor Km con inhibidor

Inhibición competitiva - Representación recíproca doble 1/Vmax -1/Km -1/(Km(1 + i/Ki))

Ejemplo Inhibidor Competitivo Ácido succínico + FAD == ácido fumárico + FADH2 El inhibidor competitivo es el ácido malónico Es un análogo estructuralmente parecido al ácido succínico

Ácido Fólico y Sulfanilamida La sulfanilamida es un análogo estructural del ácido p - aminobenzoico (PABA) PABA es el punto de partida para la síntesis de ácido fólico en las bacterias El ácido fólico es una vitamina esencial para la proliferación (división) bacteriana Sulfanilamida se usa en el tratamiento algunas infecciones

Metotrexato y Dihidrofolato El ácido fólico en sus formas de dihidro y tetrahidrofolato es coenzima de la reacción catalizada por la dihidrofolato reductasa Esta reacción es parte del metabolismo de los nucleótidos para la síntesis de DNA Metotrexato se usa en la terapia de algunos cánceres, inhibiendo la síntesis de DNA

Inhibidor No Competitivo Se une a un lugar diferente del sitio activo la enzima Se une a la enzima libre y también al complejo enzima-sustrato Por acción del inhibidor disminuye la Vmáx pero el valor de KM no se altera

E ES EI I S E + P ESI Inhibición No Competitiva El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre E y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI ni el complejo ESI son productivos

Inhibidor NO competitivo El inhibidor NO competitivo se une a la enzima en un sitio diferente del sitio activo

Inhibición NO competitiva

Inhibidor Incompetitivo Se une a un lugar diferente del sitio activo de la enzima Se une sólo al complejo enzima-sustrato Los efectos que tiene: disminuye el valor de KM y también el de Vmáx

E ES S E + P I ESI Inhibición Anticompetitiva El inhibidor sólo puede fijarse al complejo ES; el complejo ESI no es productivo

Inhibidores Irreversibles Producen inactivación permanente de la actividad enzimática Se interfiere con el normal desarrollo de una reacción o vía metabólica Ejemplos: p-cloromercuribenzoato, yodoacetato, diisopropilfluorfosfato

Inhibición Irreversible - Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima, modificándola covalentemente - Su acción no se describe por una constante de equilibrio Ki, sino por una constante de velocidad ki: E + I E’ - A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de los inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación del inhibidor. - Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles 1. Reactivos de grupos -SH 2. Organofosfóricos 3. Ligandos de metales 4. Metales pesados

Enzimas Alostéricas Son enzimas cuya estructura proteica está formada de varias subunidades No se rigen por la cinética de M - M Además del sitio o centro activo tienen sitios alostéricos o de regulación Sitio activo/sustratos; Sitio alostérico/moduladores o reguladores La relación entre la velocidad de reacción y la concentración de sustrato sigue cinética sigmoídea

Enzimas alostéricas Las enzimas alostéricas presentan estructura cuaternaria. Tienen diferentes sitios activos, unen mas de una molécula de sustrato La unión del sustrato es cooperativa la curva de velocidad presenta una forma sigmoidal

Concepto de Cooperatividad La unión de los sustratos al sitio activo de una subunidad produce un cambio conformacional que por contacto físico se transmite a las subunidades vecinas, facilitando las interacciones Modelos de unión: secuencial y concertado Ejemplos: unión Hb-O2, enzimas alostéricas y sus sustratos

Moduladores Alostéricos También reciben el nombre de efectores y pueden ser positivos o negativos Se unen al sitio alostérico que puede estar en la misma subunidad que tiene al sitio activo o en las subunidades regulatorias Su unión produce un cambio conformacional que afecta al sitio activo

Aspartato Transcarbamilasa Ác L-asp + Carbamil-P === Carbamil-asp + Pi . Primera reacción en la síntesis de pirimidinas Efector positivo: CTP Efector negativo: ATP Tiene dos subunidades catalíticas para los sustratos y tres subunidades regulatorias para los efectores

RESUMEN Las enzimas son proteínas que catalizan las reacciones biológicas Presentan especificidad por su sustrato Cada enzima presenta dos parámetros importantes Vmax (saturación de la enzima) y la Km (medida de la afinidad por el sustrato)

RESUMEN La actividad enzimática puede ser inhibida, por inhibidores competitivos (similares al sustrato) o por inhibidores no competitivos. La temperatura y el pH afectan a la enzima en su actividad catalítica. Algunas enzimas requieren de coenzimas y/o cofactores para su actividad.