Métodos de calibración: regresión y correlación Estadística en el laboratorio Métodos de calibración: regresión y correlación

Objetivo Calibración: Necesidad dado el creciente uso de métodos analíticos, en lugar de los métodos tradicionales. Ejemplo: electrodos pH, conductividad, etc. Métodos automatizados para el procesamiento de gran cantidad de muestras. Todos sujetos a potenciales errores sistemáticos que deben ser corregidos a tiempo.

Gráficos de calibración Metodología: Se procede a la medición de un analito en tres o más estándares en las mismas condiciones en las que será evaluada la muestra a analizar. Se incluye la medición de un blanco (ausencia total del analito de interés). Siempre se grafica la señal del analito en el eje y, y la concentración del analito en el eje x (consideración de errores en la medición del analito y no en la concentración del estándar). Una vez que el gráfico de calibración ha sido obtenido, el analito puede ser luego evaluado por interpolación.

Gráficos de calibración Sin embargo: ¿El gráfico de calibración muestra una relación lineal? Si es curva, ¿Cuál es la forma de la curva? Si consideramos que cada medición realizada con los estándares es propensa a errores, ¿Cuál es la mejor línea (o curva) que expresa la relación entre el analito y la señal? Asumiendo que la relación es lineal, ¿Cuáles son los errores y los límites de confianza de la pendiente y el intercepto? Cuando el gráfico es utilizado para interpolar un valor, ¿Cuál es el error y los límites de confianza para el valor obtenido? ¿Cual es la menor concentración del analito que puede ser detectado con un determinado nivel de confianza? (límite de detección)

Gráficos de calibración Asunciones importantes: Al realizar varias mediciones en un estándar, las mediciones resultantes presentan errores que son distribuidos normalmente. La magnitud del error en y es independiente de la cantidad de analito en la muestra.

Gráficos de calibración Relación lineal: Responde a la ecuación: y= mx+b Donde: y = valor de la señal del analito m= pendiente de la recta (sensibilidad) x= concentración del analito b= intercepto (blanco)

Coeficiente de correlación Identificando una relación lineal: Coeficiente de correlación momento-producto (r), que nos permite evaluar si la relación existente entre las dos variables es lineal. No subestimar el poder de un análisis gráfico.

Gráficos de calibración Interpretando el valor de r:

Gráficos de calibración Ejemplo: Una solución acuosa estándar es examinada mediante espectrometría de fluorescencia. Los siguientes valores son obtenidos: Determine el coeficiente de correlación (r) medición 1 2 3 4 5 6 7 Intensidad 2.1 5.0 9.0 12.6 17.3 21.0 24.7 Concentración 8 10 12

Gráficos de calibración xi yi (xi – x) (xi – x)2 (yi – y) (yi – y)2 (xi – x) (yi – y) Suma

Gráficos de calibración

Gráficos de calibración Considere: El valor de r podría ser cercano a uno, y sin embargo la relación entre las variables podría no ser lineal. Un r de 0 únicamente nos indica que la relación no se ajusta a un modelo lineal, sin embargo pudiera existir otro modelo de relación.

Gráficos de calibración ¿Como saber si la relación lineal es significativa? Uso del estadístico t: Donde: Ho= no hay correlación lineal Uso de la tabla t para dos colas y (n-2) grados de libertad.

La línea de la regresión Mejor relación Si tenemos evidencia de una relación lineal significativa, la siguiente pregunta es cuales son las características (pendiente e intercepto) de esa línea que se ajusta de la mejor manera a todos los datos. Estrategia: Esa línea es estimada mediante la reducción de los errores entre los valores medidos y los predichos por la función lineal (línea de regresión): Minimización de la suma de los cuadrados de los residuos.

La línea de la regresión Puede ser demostrado que la mejor “línea” que minimiza los errores esta dada por:

La línea de la regresión Ejercicio: Calcule la pendiente y el intercepto de la línea de regresión en base a los datos del ejemplo previo.

Errores en la pendiente y el intercepto

Errores en la pendiente y el intercepto Las lecturas realizadas presentan un cierto error en la dirección y, que puede ser estimado por el estadístico sy/x para errores aleatorios en y:

Errores en la pendiente y el intercepto Errores aleatorios en la pendiente (Sb) y el intercepto (Sa):

Errores en la pendiente y el intercepto Donde se puede estimar los limites de confianza para: Pendiente b  t(n-2)Sb Intercepto: a  t(n-2)Sa

Errores en la pendiente y el intercepto Ejercicio: Calcule las desviaciones estándar y los límites de confianza de la pendiente y el intercepto de la línea de regresión elaborada anteriormente.

Calculo de una concentración y su error aleatorio Una vez obtenida la ecuación de la curva, es fácil interpolar la concentración del analito (y) en base a la intensidad de la señal (x). Debido a que tanto la pendiente, como el intercepto están sujetos a errores, es necesario también estimar el error asociado a la medición. Dichos error total (aleatorio y sistemático) es de difícil determinación.

Calculo de una concentración y su error aleatorio Simplificando: Donde yo es el valor experimental de y a partir del cual se determinó xo. Sxo es la desviación estándar estimada de xo.

Calculo de una concentración y su error aleatorio En ocasiones, se puede recurrir a realizar m lecturas para obtener el valor de yo, obteniéndose que sxo sería calculada: Donde m es el número de lecturas realizadas para cada medición.

Calculo de una concentración y su error aleatorio Límites de confianza: Los límites de confianza para la medición realizada se calcularán mediante: xo  t(n-2)sxo (con n-2 grados de libertad).

Calculo de una concentración y su error aleatorio Ejercicio: Empleando los datos del ejemplo anterior, determine los valores de xo, sxo, y los límites de confianza de xo para soluciones con intensidades de fluorescencia de 2.9; 13.5 y 23.0 unidades.

Calculo de una concentración y su error aleatorio Observe que: Los límites de confianza son menores cuando yo se aproxima al valor promedio de y. Por tal motivo, la mayor precisión en las mediciones se obtendrán para lecturas que estén cerca al centro de la curva de calibración.

Calculo de una concentración y su error aleatorio Como mejorar: Aumentando el número de puntos de calibración (n). Realizando más mediciones (m) para la determinación de yo. Considere que demasiadas mediciones podrían no mejorar significativamente la precisión. Considere que un incremento de n acarrea más estándares que preparar, mientras que un número pequeño de n significa mayores valores de t. Se recomienda 6 puntos de calibrado y varias mediciones de yo. Si existen restricciones para m y n, entonces la mejor opción (en base a la ecuación anterior) es que m=n.

Calculo de una concentración y su error aleatorio Sy/x Sa(intercepto) Sb(pendiente) Intercepto Pendiente

Límites de detección Definición: Aquella concentración que proporciona una señal en el instrumento (y) significativamente diferente de la señal del “blanco” o “ruido” de fondo. Si bien es cierto no existe un consenso en cuanto a cuando es “significativamente diferente”, se suele generalizar que: Límite de detección (LOD) = ŷblanco + 3sblanco Donde para una calibración univariada sblanco= sy/x

Límites de detección

Límites de detección Ejercicio: Estime el límite de detección del ejemplo anterior.

Datos anómalos en la regresión Estrategia: Identificados mediante el análisis de los residuales (yi-ŷi). Sin embargo, los residuales no son independientes pues su suma siempre será igual a cero. Por tal razón un test Q no es aplicable. Necesidad de recurrir a métodos gráficos

Datos anómalos en la regresión

Regresión para comparación de métodos analíticos Justificación: Cuando comparamos dos métodos para la determinación de un analito a varias concentraciones, podemos hacer uso de las técnicas estadísticas anteriores. Sin embargo, cuando dicha evaluación se lleva a cabo en un amplio espectro de concentraciones, se debe recurrir a una regresión. Logrando identificar presencia de errores sistemáticos.

Regresión para comparación de métodos analíticos Ideal: Pendiente = 1 r = 1 Intercepto = 0 Sin embargo, imposible debido a errores aleatorios.

Regresión para comparación de métodos analíticos Estrategia: Contrastar que el origen de la recta difiere significativamente de cero. Contrastar que la pendiente difiere significativamente de uno. Haciendo uso de mediciones únicas o promediadas realizadas por ambos métodos.

Regresión para comparación de métodos analíticos Ejercicio: