Preparación Células Competentes Dr. Jesús Lee-Borges Dr. José M. Planas Dra. Liza Jiménez Universidad de Puerto Rico – Aguadilla Departamento de Ciencias Naturales

Objetivos Repasar principios básicos y protocolo de preparación de bacterias competentes. Preparar bacterias competentes. Realizar protocolo de transformación.

Pasos a seguir para la clonación: Aislamiento Amplificación (PCR) Digestión ER : Plásmido y DNA a clonar Ligación (in vitro, ligasa) Transformación (bacterias competentes) Selección “Screening” Para que quiero transformar?

Células competentes capaces de permitir la entrada de DNA a través de su membrana Cambios en las membranas que permiten el paso de moleculasd de DNA exogenos

Maneras de obtener bacterias competentes Comerciales Preparando “stocks” de manera local Companias que venden cepas creadas con especificiaciones Hoy nosotros vamos a hacer una cepa de ellas.

Factores críticos en obtener transformación La pureza de los reactivos usados en los buffers de transformación La etapa de crecimiento de las células Bacterias crecidas del “stock” original y almacenadas a -70 C Lag  Log  Plateau La limpieza del equipo usado Presencia de detergentes Porque no salen los exptos?: pureza/ No tenemos una cepa original. Control sobre equipo usado, detergentes, agua, etc Detergentes ..membranas.. Fosfolipidos,… etc

Métodos para obtener células competentes Electroporación (electrotransformación) Neuman et al. 1982, Potter et al. 1984, Fromm et al. 1985, Chu et al. 1987) Mas fácil, mas eficiente Transformación química CaCl2

Electroporación Aplicación de un elevado voltaje a las células durante un periodo de tiempo muy corto. Las membranas se despolarizan sus membranas y se forman pequeños orificios por los que penetran las moléculas (proteínas, DNA,...) que se encuentran alrededor. Ventaja: se aplica a millones de células a la vez; se obtienen eficiencias de entrada de las moléculas del 100% de las células que sobreviven (centenares de miles a millones).

Transformación química Competent Cells CSHL DNA Learning Center. Mandel & Higa (1970) CaCl2

Reacción de Transformación http://www.dnalc.org/view/15916-DNA-transformation.html

Protocolo Empezamos con E. coli en caldo de LB Centrifugar 4000 rpm por 10 minutos Decantar el medio, invertir el tubo por 1 minuto Resuspender el “pellet” en 1 ml de 0.1 M CaCl2 (en hielo) (Cl-/ Ca+2 / Hielo) Centrifugar por 10 minutos Decantar Repetir el paso 4

Protocolo (continuación) Transferir 1.0 mL de las bacterias competentes a un tubo de ensayo. Añadir la reacción de ligación. Transferir los tubos a un baño de maría a 42°C por 90 segundos “Heat shock” Regresar los tubos al hielo por 2 minutos. Añadir 175 uL de LB, mezclar usando el “Vortex” Heat shock proteins- con el choque de T se activan genes de Hsproteins, Esta el DNA dentro - Heat Shock proteins facilitan la integracion del DNA exogeno al genoma bacterial

Protocolo (cont.) Transferir la mezcla de las células competentes + el DNA recombinante al LB soft agar, mezclar. Colocar el LB soft agar sobre una placa de LB agar y mezclar hasta que cubra la placa completa (doble capa) Esperar hasta que se endurezca, invertir la placa e incubarla a 37°C por 8-12 horas.

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