Membrane Lipid Modulations Remove Divalent Open Channel Block from TRP-Like and NMDA Channels Moshe Parnas, Ben Katz, Shaya Lev, Vered Tzarfaty, Daniela Dadon, Ariela Gordon-Shaag, Henry Metzner, Rami Yaka, and Baruch Minke Department of Physiology and the Kuühne Minerva Center for Studies of Visual Transduction, Department of Pharmacology, Faculty of Medicine of The Hebrew University, and Hadassah Academic College, Jerusalem 91120, Israel The Journal of Neuroscience, :2371– Esta presentación está en

El bloqueo por del canal abierto es un proceso en el que los iones entran al canal pero quedan atascados. Open channel block (OCB) Un ejemplo que he visto en estos seminarios es el bloqueo por Mg 2+ de los canales NMDA, que se abren con ácido glutámico. Los iones magnesio vienen del medio extracelular y se mantienen atrapados en el canal al potencial de reposo. Los canales TRP y TRPL, del ojo de la Drosophila, que se abren por una cascada de procesos iniciada por la luz también son bloqueados por los iones divalentes del medio extracelular. OCB. El bloqueo se libera con la despolarización porque el campo expulsa a los iones Mg 2+ hacia el medio extracelular. ¿Cómo es que los canales TRP y TRPL conducen corriente al ser activados por luz y estando en el potencial de reposo, supuestamente bajo Open channel block? Esta es una dificultad fundamental para entender la foto transducción en Drosophila y este paper la resuelve. En este paper se demuestra que la aplicación de lípidos a los canales TRP libera el OCB de los canales TRP sin necesidad de despolarizar la membrana.

+ 0 mV -60 mV Canal abierto bloqueado Dos mecanismos de liberación del OCB mV Canal abierto bloqueado 0 mV Cambio en los lípidos libera el bloqueo Cambio de composición de la bicapa por la actividad de la fosfolipasa C, PLC -60 mV + 0 mV -60 mV Canal abierto conductor 0 mV + +20mV Despolarización libera el bloqueo Cambio voltaje por la apertura de otros canales 0 mV +40mV Canal abierto conductor

Material biológico y métodos Omatidios disociados de Drosophila, de las cepas trp P343 y norpA p24 ;;trp p343. Whole cell voltage clamp. Estimulación por epi- iluminación con luz amarilla, 13 mW/cm 2 o menos con atenuador logarítmico. Células Scheinder expresando TRPL-eGFP en forma estable y canales NMDA(NR1 y NR2) expresados en forma transitoria. Al medio de cultivo de las células se agregó CuSO  M 24 horas antes del experimento fisiológico, para inducir la expresión de los canales. Whole cell voltage clamp, inside out patch clamp. Rebanadas de hipocampo de cerebro de rata. Registro intracelular de células piramidales de la región CA1 estimuladas por electrodos bipolares ubicados en las aferencias de colaterales/comisurales de Schaffer. Whole cell voltage clamp.

Canales TRPL expresados en células Schneider S2. Whole cell patch clamp. Solución intracelular Cs mM. Naranja, control sin TRPL Solución intracelular con Ca 2+ Verde Na mM + Ca mM Negro Na mM + Ba mM Violeta Na mM +1 mM EGTA Solución intracelular sin Ca 2+ Azul Na mM +1 mM EGTA Verde Na mM + Ca mM Negro Na mM + Ba mM Los iones bivalentes bloquean el canal TRPL. Open Channel Block, OCB Parmas et al 2007 JGP 129:12-28 El OBC se manifiesta por una fuerte rectificación de salida de la curva I/V. Un curva I/V lineal es indicación de liberación del OBC

Omatidios aislados, whole cell, trp P343 Curva I/V en Steady state Curva 1. En la oscuridad, canales cerrados Curva 2. Canales abiertos con luz (rosa) o a los 6 segundos de aplicar ácido linoléico (LA) 60  M (azul). La curva I/V presenta fuerte rectificación de salida porque los canales abiertos están bloqueados (OCB) a potenciales negativos por los iones bivalentes de la solución extracelular (Mg 2+ 4 mM) Curva 3. Canales abiertos libres de OCB a los 20 segundos bajo LA 60  M Curva 4. Canales abiertos a los 80 segundos bajo LA 60  M bloqueado por Ca 2+ 10mM El ácido linoleico abre los canales a los 6 s. A los 20s los libera del bloqueo por Mg 2+ 4 mM

Bajo el efecto del ácido linoleico, LA, a corriente positiva, de salida, aumenta antes que la corriente negativa, de entrada. Omatidios aislados, whole cell, trp P343 El ácido linoleico abre los canales a los 6 s. A los 20s los libera del bloqueo por Mg 2+ 4 mM

Omatidios aislados, whole cell, trp P343 Curva I/V en Steady state Curva 2. Canales abiertos con luz (rosa) o a los 6 segundos de aplicar ácido linoleico (LA) 60  M (azul). La curva I/V presenta fuerte rectificación de salida porque los canales abiertos están bloqueados (OCB) a potenciales negativos por los iones bivalentes de la solución extracelular (Mg 2+ 4 mM) Inset. Respuesta transitoria a la luz medida a -60 mV, Se registra un pico de 4 nA a un potencial donde los canales están bloqueado en steady state. El bloqueo por Mg 2+ es instantáneo en esta escala de tiempo. ¿Cómo es que se registra una corriente transitoria?

“The apparent contradiction between the results of the I–V curve and the LIC presents a fundamental difficulty in understanding Drosophila phototransduction, which needs to be resolved”. mV Omatidios aislados, whole cell, trp P343

Curva I/V en Steady state Curva 2. Canales abiertos con luz (rosa) o a los 6 segundos de aplicar ácido linoleico (LA) 60  M (azul). La curva I/V presenta fuerte rectificación de salida porque los canales abiertos están bloqueados (OCB) a potenciales negativos por los iones bivalentes de la solución extracelular (Mg 2+ 4 mM) Inset. Respuesta transitoria a la luz medida a -60 mV, Se registra un pico de 4 nA a un potencial donde los canales están bloqueado en steady state. El bloqueo por Mg 2+ es instantáneo en esta escala de tiempo. ¿Cómo es que se registra una corriente transitoria? Hipótesis. La luz y el ácido linoleico tienen un efecto doble 1.abrir los canales, 2.liberar el bloqueo de los canales abiertos.

Omatidios aislados, whole cell, trp P343 Curva I/V en Steady state Curva 2. Canales abiertos con luz (rosa) o a los 6 segundos de aplicar ácido linoleico (LA) 60  M (azul). La curva I/V presenta fuerte rectificación de salida porque los canales abiertos están bloqueados (OCB) a potenciales negativos por los iones bivalentes de la solución extracelular (Mg 2+ 4 mM) Inset. Respuesta transitoria a la luz medida a -60 mV, Se registra un pico de 4 nA a un potencial donde los canales están bloqueado en steady state. El bloqueo por Mg 2+ es instantáneo en esta escala de tiempo. ¿Cómo es que se registra una corriente transitoria? Estrategia. Los canales TRPL expresados en células S2 están siempre abiertos. En este sistema podemos estudiar el bloqueo independientemente de la apertura de los canales

TRPL expresado en células Schneider S2. Curva 1. Canales abiertos en la oscuridad. La curva I/V presenta fuerte rectificación de salida porque los canales abiertos están bloqueados (OCB) a potenciales negativos por los iones bivalentes de la solución extracelular (Mg 2+ 4 mM) Curva 2. Canales abiertos en la oscuridad, a los 50 segundos de aplicar ácido linoleico 40  M, bloqueados por Mg 2+ 4 mM (OCB). Curva 3. Canales abiertos en la oscuridad, a los 100 segundos de aplicar ácido linoleico 40  M. Parcialmente liberados del OCB. Curva 4. Canales abiertos en la oscuridad, a los 150 segundos de aplicar ácido linoleico 40  M. Mayormente liberados del OCB. Curva 5. Canales abiertos en la oscuridad, a los 150 segundos de aplicar ácido linoleico 40  M. Parcialmente bloqueados por Ca 2+ 5 mM.

TRPL expresado en células Schneider S2. Curva 1. Canales abiertos en la oscuridad. La curva I/V presenta fuerte rectificación de salida porque los canales abiertos están bloqueados (OCB) a potenciales negativos por los iones bivalentes de la solución extracelular (Mg 2+ 4 mM) Curva 2. Canales abiertos en la oscuridad, a los 50 segundos de aplicar ácido linoleico 40  M, bloqueados por Mg 2+ 4 mM (OCB). Curva 3. Canales abiertos en la oscuridad, a los 100 segundos de aplicar ácido linoleico 40  M parcialmente liberados del OCB. Curva 4. Canales abiertos en la oscuridad, a los 150 segundos de aplicar ácido linoleico 40  M mayormente liberados del OCB. Curva 5. Canales abiertos en la oscuridad, a los 150 segundos de aplicar ácido linoleico 40  M parcialmente bloqueados por Ca 2+ 5 mM. Controles: 1.El ácido linoleico (LA) 100  M no produce corriente en ausencia TRPL. 2.El usencia de LA no se observa aumento de la corriente con el correr del tiempo. 3.La “isoforma” Na-LA, que es soluble en agua y no forma micelas produce el mismo efecto que LA sobre las células con TRPL. Notas. Tienen el mismo efecto que LA: 1.El ácido oleico (PUFA?) 2.Un diacil glicerol (DAG) de ácido esteárico y araquidónico 3.Los canales TRP no se expresan en las células Schneider S2. Conclusión. El ácido linoleico libera el OCB de los canales TRPL sin necesidad de despolarización. Pregunta ¿El ácido linoleico libera el OBC en los canales TRP?

Omatidios aislados, whole cell, trpl 302 Curva 1 roja. Canales cerrados en la oscuridad. Curva 2 azul. Canales abiertos en la oscuridad, a los 140 segundos de aplicar ácido linoleico 25  M, bloqueados por Mg 2+ 4 mM (OCB). Curva 3. Canales abiertos en la oscuridad, a los 180 segundos de aplicar ácido linoleico 25  M totalmente liberados del OCB. Curva 4 verde. Canales abiertos en la oscuridad, a los 210 segundos de aplicar ácido linoleico 40  M bloqueados parcialmente al exponerlos por 20 s a Ca 2+ 10mM. Curva 5. Canales abiertos en la oscuridad, a los 210 segundos de aplicar ácido linoleico 40  M bloqueados totalmente al exponerlos por 60 s a Ca 2+ 10mM Conclusión. El ácido linoleico libera el OCB de los canales TRP y TRPL sin necesidad de despolarización.

Tienen el mismo efecto que LA: 1.El ácido oleico (PUFA) 2.Un diacil glicerol (DAG) de ácido esteárico y araquidónico Estos componentes son producto de la hidrólisis de fosfolípidos catalizada por fosfolipasa-C, PLC. Pregunta : ¿El ácido linoleico es activador de la fosfolipasa-C, PLC? Para medir la actividad de PLC preparan células S2 con eGFP unida a una molécula,que se a su vez se une a PIP 2 o IP 3. Se espera ver la eGFP preferentemente en la membrana de las células donde está estacionado el PIP 2. Al activar la PLC se suelta de la membrana y se espera que aparezca en toda la célula. Para controlen caso que el LA no hiciera efecto, la células S2 también llevan el receptor DM1 que activa la PLC al agregar su agonista carbacol, (CCH)

Para medir la actividad de PLC preparan células S2 con eGFP unida a una molécula,que se a su vez se une a PIP 2 o IP 3. La eGFP se ve preferentemente en la membrana de las células donde esta estacionado el PIP 2. Al activar la PLC se suelta de la membrana y aparece en toda la célula. Para control la células S2 también llevan el receptor DM1 que activa la PLC al ligar su agonista carbacol, (CCH) Conclusión. El ácido linoleico no funciona como activador de la PLC. Resultado

El ácido linoleico libera el OCB de los canales TRPL en ausencia de PLC Omatidios aislados, whole cell, norpA p24 ;;trp p343 TRPL, sin PLC Curva 1 roja. Canales cerrados en la oscuridad. Curva 2 azul. Canales abiertos en la oscuridad, a los 140 segundos de aplicar ácido linoleico 60  M, bloqueados por Mg 2+ 4 mM (OCB). Curva 3. Canales abiertos en la oscuridad, a los 120 segundos de aplicar ácido linoleico 60  M parcialmente liberados del OCB. Curva 4. Canales abiertos en la oscuridad, a los 180 segundos de aplicar ácido linoleico 60  M totalmente liberados del OCB. Curva 5 verde. Canales abiertos en la oscuridad, a los 200 segundos de aplicar ácido linoleico 60  M bloqueados totalmente al exponerlos por 60 s a Ca 2+ 10mM El ácido linoleico libera el OCB de los canales TRPL en ausencia de PLC

La activación de PLC libera el OCB de los canales TRPL Para demostrar que activación de la PLC libera el OCB de los canales TRPL preparan células S2 con eGFP unida a una molécula que se a su vez se une a PIP 2 o IP 3. Además le ponen el receptor DM1 que activa la PLC al ligar su agonista carbacol, CCH. Encima de todo esto le ponen canales TRPL. La activación de PLC libera el OCB de los canales TRPL

La iluminación libera la OCB de los canales TRPL Para demostrar la liberación del OBC por luz, miden la corriente a -80 y +80 mV a diferentes momentos después de instalar la iluminación. La iluminación libera la OCB de los canales TRPL sin necesidad de despolarización lo que permite una robusta light activaded current, LIC, en los rabdómeros. Tiempo, ms

El bloqueo por Mg 2+ de los canales TRPL es dependiente del voltaje. El ácido linoleico, LA, hace independiente del voltaje el bloqueo por Mg 2+.

Canales únicos TRPL en células Schneider S2 inside out patch clamp. Mg 2+ 4 mM. Las corrientes del canal único revelan que el ácido linoleico, LA, disminuye la rectificación de salida, indicación de alivio del OCB

Canales únicos TRPL en células Schneider S2 inside out patch clamp. Mg 2+ 4 mM, +100 mV, 10  M LA. La corriente del canal único aumenta al liberar el OCB con linoleico, LA.

Bloqueo por iones orgánicos monovalentes de diferente diámetro. Dietilamina, trietilamina, tetraetilamina Células S2, whole cell patch clamp, Cs + interior, iones monovalentes en el exterior. Sin iones bivalentes. Tetrametilamina no da corriente de entrada. No pasa por el canal. Tetrametilamina

Bloqueo por iones orgánicos monovalentes de diferente diametro. Dietilamina, trietilamina, tetraetilamina Células S2, whole cell patch clamp, Cs + interior, iones monovalentes en el exterior. Sin iones bivalentes. Tetrametilamina no da corriente de entrada. No pasa por el canal. Trimetilamina da pequeñas corrientes de entrada. Trietilamina

Bloqueo por iones orgánicos monovalentes de diferente diametro. Dietilamina, trietilamina, tetraetilamina Células S2, whole cell patch clamp, Cs + interior, iones monovalentes en el exterior. Sin iones bivalentes. Tetrametilamina no da corriente de entrada. No pasa por el canal. Trimetilamina y dietilamina dan pequeñas corrientes de entrada. Potenciales bi-iónicos Concentration ratio? : Tetrametilamina mV (!) Trimetil amina -8.5 mV Dietilamina 8.8 mV. La aplicación de ácido linoleico 40mM: 1.Aumenta dramáticamente la corriente de entrada, que llevada por la dietilamina 2.Aumenta también la corriente de salida que es llevada por Cs + 3.No cambia el potencial de inversión de la corriente. No cambia las razones de permeabilidad.

Bloqueo por iones orgánicos monovalentes de diferente diámetro. Dietilamina, trietilamina, tetraetilamina Células S2, whole cell patch clamp, Cs + interior, iones monovalentes en el exterior. Sin iones bivalentes. Los potenciales bi-iónicos Cs/Na y Cs/dietil amina son iguales. Na y dietilamina tienen la misma permeabilidad. Pero la corriente llevada por el Na es mucho mayor que la llevada por la amina.

Bloqueo por iones orgánicos monovalentes de diferente diámetro. Dietilamina, trietilamina, tetraetilamina Células S2, inside out excised patch clamp, Cs + interior 130 mM, iones monovalentes en el exterior 130 mM. V m = 130 mV. Sin iones bivalentes. Na y dietilamina tienen la misma permeabilidad. Pero la corriente llevada por el Na + es mucho mayor que la llevada por la dietilamina. Conclusión: los iones orgánicos monovalentes bloquean el canal porque transitan muy lentamente. Jorge Sánchez et al JGP 87: ,1986 El ácido linoleico libera el OCB porque aumenta la rapidez del paso de los iones que bloquean el canal.

La compleja cinética de los canales TRPL expresados en las células de Schneider S2. Parnas et al 2007, JGP129:17. Análisis de las corrientes de canal único demuestra la existencia de dos clases de eventos abiertos: cortos, O S y largos, O L. En ausencia de iones bivalentes la probabilidad de encontrar el canal abierto es independiente del voltaje Por lo tanto todas estas constantes cinéticas son independientes del voltaje La cinética se caracteriza por presentar burts de actividad En presencia de iones bivalentes la probabilidad del canal abierto se hace dependiente del voltaje. Se acorta la duración de los abiertos largos.

La compleja cinética de los canales TRPL expresados en las células de Schneider S2. Parnas et al 2007, JGP129:17. En presencia de iones bivalentes la probabilidad del canal abierto se hace dependiente del voltaje. Se acorta la duración de los abiertos largos y no la de los cortos. B 1 y B 2 son los estados bloqueados. La duración de los eventos abiertos es independiente del voltaje, k b es independiente de voltaje. La duración de los cerrados se acorta con la despolarización, k -b depende del voltaje.

La compleja cinética de los canales TRPL expresados en las células de Schneider S2. Parnas et al 2007, JGP129:17. En presencia de iones bivalentes la probabilidad se acorta la duración de los bursts y el número de aperturas dentro de un bursts. El burst se termina con mayor probabilidad desde los estados bloqueados B 1 o B 2 que de los estados abiertos O L u O S

La compleja cinética de los canales TRPL expresados en las células de Schneider S2. Parnas et al 2007, JGP129:17. El burst se termina desde los estados bloqueados B 1 o B 2 El ácido linoleico no afecta la duración de los estados abiertos, pero aumenta la duración de los bursts y el número de aperturas dentro de un bursts. LA aumenta k -b EL OCB se libera con LA porque los iones bloqueadores pasan a través del canal

Los canales TRPL se liberan del OCB por cambios en los lípidos de la bicapa. Otras maneras de alterar los lípidos: 1.Expandir la membrana usando soluciones hipo- osmóticas. 2. Secuestrar el PIP 2 usando poli-lisina.

Expandir la membrana usando soluciones hipo-osmóticas.

Secuestrar el PIP 2 usando poli-lisina.

Canal NMDA expresado en células Schneider S2. Whole cell patch clamp. Curva 1. Canales abiertos con NMDA 30  M + glicina 30  M, bloqueados por Mg 2+. Curva 2. Ácido linoleico 40  M por 200 s libera el OCB a potenciales positivos. Curva 3. Ácido linoleico 40  M por 600 s libera el OCB a potenciales positivos y negativos. Curva 4. Aplicación de Mg mM bloquea los canales aun en presencia de LA.

Canal NMDA expresado en células Schneider S2. Inside out patch clamp. 100mV. Al ácido linoleico aumenta la duración de los bursts, la probabilidad del canal abierto y la conductancia del canal único. Todo igual que para TRPL.

Canal NMDA nativo en neuronas piramidales de la zona Ca1 del hipocampo. Whole cell voltage clamp. EPSC evocados por estimulación ortodrómica en presencia de 100  M picrotoxina (no GABA receptors) + 10  M CNQX (no AMPA/kainate receptors) extracelulares. Rebanadas de cerebro de rata. Control LA 30  M El ácido linoleico también libera el OCB de los canales NMDA in situ. EPSC = Excitatory Post Synaptic Current