LIC. NUTRICIÓN QUÍMICA BIOLÓGICA 2014

Bolilla 2: PROGRAMA ANALITICO Y/O DE EXAMEN LIC. NUTRICIÓN QCA. BIOLÓGICA PROGRAMA ANALITICO Y/O DE EXAMEN    Bolilla 2: ENZIMAS: Naturaleza Química- Propiedades Generales- Nomenclatura y Clasificacion- Coenzimas, importancia de las Vitaminas. Grupos Prostéticos. Compartimentalización. Complejo ES- Actividad Enzimática: Unidad de enzima- Actividad específica- Actividad molecular Factores que afectan la actividad enzimatica: [Enzima]- pH – T- [S], Ecuación de Michaelis Menten y Ecuación de Lineweaver Burk- Inhibición de las enzimas, competitiva y no Competitiva. Regulación Enzimática: Enzimas alostéricas (propiedades y cinética)- Regulación Covalente-Zimógenos. Isoenzimas: Propiedades e importancia.

¿Cómo se mide la Actividad de una Enzima? La Actividad de una enzima puede determinarse midiendo La cantidad de producto que se forma ó La cantidad de sustrato que se consume En un tiempo dado En una mezcla que contenga todos los factores requeridos para la reacción ¿Cómo se mide la Actividad de una Enzima? [S] + E [ ES ] E + [P]

mmol de S transformados mmol de S transformados/min ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Formas de expresar la Actividad de una Enzima Unidades Internacionales Cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 mmol de S por minuto Actividad Molecular ó Numero de Recambio Moléculas de S convertibles en P por unidad de tiempo y por molécula de enzima U.I.E. = mmol de S transformados min (1 katal = 6 x 107 U.I.E.) Actividad molecular = Mol de enzima mmol de S transformados/min

Actividad enzimática por cada miligramo de proteína Actividad Específica Actividad enzimática por cada miligramo de proteína presente en la muestra A B + Prot.Tot: ∑ + Prot.Tot: ∑ + Prot.Tot: ∑ D Actividad específica U.I.E. mgr de proteína = Activ. Enzimática Prot. totales Prot.Tot: ∑

en las reacciones enzimáticas? ¿Qué cambios ocurren en las reacciones enzimáticas? Las transformaciones químicas en los sistemas biológicos se acompañan de cambios energéticos. Conocer estos cambios permite entender la lógica y sentido del METABOLISMO celular. Los seres vivos requieren y utilizan la energía de su entorno, para realizar trabajo.

Reacción NO espontánea Energía libre (G) (Energía de Gibbs): es la fracción de la energía liberada en las reacciones bioquímicas que es disponible para realizar trabajo útil. Se puede predecir el sentido de una reacción química, si ocurrirá espontáneamente o no. Si los P tienen menos energía que los Reactivos Si G del sistema disminuye (- DG) La reacción es exergónica Si los P tienen más energía que los Reactivos Si G del sistema aumenta (+DG) La reacción es endergónica Reacción espontánea Reacción NO espontánea

Energía de aactivación de la reacción CATALIZADA Diagrama de coordenadas de una reacción enzimática catalizada y sin catalizar Energía Libre (G) Estado de transición o de activación Energía de activación de la reacción NO catalizada Energía de aactivación de la reacción CATALIZADA Enz-S Enz-P S P Progreso de la reacción

Energía de activación (Ea): es la energía necesaria para alcanzar el estado activado El estado de transición o barrera de activación, representa los cambios que se generan en la molécula del S. Es por esto que las reacciones sin catalizar tienden a ser muy lentas. Todas las moléculas biológicas son muy estables al pH neutro, temperatura suave y ambiente acuoso en el interior de las células. Todas las reacciones químicas celulares se llevan a cabo porque las enzimas actúan disminuyendo la barrera energética entre el S y el P. Las enzimas actúan disminuyendo la Ea.

Factores que afectan la actividad enzimática Concentración de Enzima pH Temperatura Concentración de Sustrato

Efecto de la concentración de Enzima sobre la actividad Concentración saturante de sustrato, pH y T°C constantes [E] Vo Se establece la relación entre Cantidad y Actividad de enzima Velocidad de reacción directamente proporcional a la concentración de enzima

Los cambios del pH del medio afectan el estado de ionización de grupos funcionales de las moléculas de E y S. Para la formación del [ES] es necesaria una correcta distribución de las cargas en ambas moléculas pH óptimo Concentración de sustrato, E y T°C constantes 6 8 pH óptimo es aquel en el cual el estado de disociación de los grupos esenciales es el más apropiado para interaccionar en el complejo ES

Ejemplos de enzimas con diferentes pH óptimo

Influencia de la Temperatura sobre la actividad enzimática Concentración de S, E y pH constantes actividad por de la temperatura Temperatura óptima Temperatura(°C) Actividad enzimática de temperatura provoca desnaturalización

Influencia de la concentración de Sustrato sobre la velocidad inicial [E], pH, T°C: constantes Curva hiperbólica

Ecuación de Michaelis – Menten Cinética del estado estacionario Ecuación de Michaelis – Menten Reacción de orden cero Km = [S] cuando V0 = ½ Vmáx Reacción de 1° orden Hablar de Km y orden de la reaccion V0= Velocidad inicial de la reacción Vmáx= Velocidad Máxima Km= constante de Michaelis [S]= concentración del sustrato V0= Velocidad inicial de la reacción Vmáx= Velocidad Máxima Km= constante de Michaelis [S]= concentración del sustrato

Ecuación de Michaelis – Menten Constante de Michaelis (Km) = Km, Constante de Michaelis Constante de Michaelis (Km) Es característica de una enzima y su sustrato particular Refleja la afinidad del sustrato por la enzima, en relación inversa: menor Km mayor afinidad E por el S Km es numéricamente igual a la concentración del sustrato que corresponde a una velocidad de reacción igual a la mitad de la velocidad máxima. En condiciones definidas de pH, T°C, Km tiene un valor fijo para cada enzima y sirve para caracterizarla. Km = [S] cuando V0 = ½ Vmáx

Gráfica doble recíproca o de Lineweaver-Burk Ordenada al Origen = 1 / Vmáx Pendiente = Km / Vmáx Intersección con eje X = - 1 / Km

INHIBICIÓN ENZIMÁTICA COMPETITIVA NO COMPETITIVA ACOMPETITIVA INHIBICION REVERSIBLE POR ENLACE COVALENTE (Análogos del estado de transición) INHIBIDOR SUICIDA DIFP Quimotripsina INHIBICION IRREVERSIBLE Penicilina Transpeptidasa Alopurinol Xantina oxidasa

INHIBICION REVERSIBLE INHIBICION COMPETITIVA E E + S ES E + P I EI I + [E] [I] [EI] Ki = S     KM ap = Km(1 + [I]/Ki)

Ejemplo de Inhibidor competitivo Succinato + FADH2 Fumarato + FAD+ Succinato deshidrogenasa COO- (CH2)2 COO- CH2 Succinato Malonato

v Gráfica de M-M Km Km ap [S] 1/v Gráfica de L-B 1/[S] -1/Km -1/Kmap

INHIBICION NO COMPETITIVA S E + S ES E + P + I EI + I ESI I E S I + S

Km [S] v Gráfica de M-M -1/Km 1/[S] 1/v Gráfica de L-B Vmáx ap.= Vmax.s/I      Km(1 + [I]/Ki)

Características de los diferentes tipos de inhibición reversible Tipo de El Inhibidor Efecto Efecto inhibición se une a s/Vmáx s/Km Competitiva E Ninguno Aumenta No competitiva E y ES Disminuye Ninguno Km c/I. = Km s/Inh. x (1+ [I]/Ki) Vmáx c/I= Vmáx. s/Inh. / 1 + [I]/ Ki

Acción de inhibidores a distinta concentración COMPETITIVA NO COMPETITIVA Pendiente = Km / Vmáx

INHIBICION IRREVERSIBLE . Por unión covalente del inhibidor - Acetilcolinesterasa - Quimotripsina Enzima inactivada Diisopropilfluorfosfato (DFP)

INHIBICION IRREVERSIBLE . Inhibidor suicida Se une al sitio activo de la enzima y ésta cataliza la modificación del inhibidor a otro compuesto que permanece unido a la enzima. El ALOPURINOL es un inhibidor suicida que actúa sobre la enzima xantina oxidasa (degradación de purinas). Se forma el oxopurinol el cual queda unido a la enzima.

REGULACION DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS REGULACION DE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS ENZIMAS ALOSTERICAS REGULACION POR PROTEINAS REGULACION POR PROTEOLISIS REGULACION COVALENTE ENZIMAS INDUCIBLES REGULACION DE LA SINTESIS DE LAS ENZIMAS

MODULADORES POSITIVOS MODULADORES NEGATIVOS ENZIMAS ALOSTERICAS Enzima 1 2 3 4 Enzima 1 ENZIMA ALOSTERICA MODULADORES POSITIVOS MODULADORES NEGATIVOS

PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS ALOSTERICAS Poseen un sitio de unión a un metabolito regulador (sitio alostérico) La unión del metabolito a la enzima es de carácter reversible y no covalente. En general poseen dos o mas sitios reguladores. La mayoría posee dos o mas cadenas polipeptídicas o subunidades. En general tienen un comportamiento cinético sigmoideo

MODULADORES POSITIVOS MODULADORES NEGATIVOS ENZIMAS ALOSTERICAS MODULADORES POSITIVOS MODULADORES NEGATIVOS

CINETICA DE UNA ENZIMA ALOSTERICA Curva Sigmoidea

Regulación de la actividad de la Aspartato transcarbamilasa (ATCasa) Aspartato (mM)

EJEMPLOS DE ENZIMAS ALOSTERICAS Hexoquinasa, Fosfofructoquinasa y Piruvato Quinasa Vía glicolítica AcetilCoA carboxilasa Biosíntesis de lípidos Aspartato Transcarbamilasa Biosíntesis de nucleó tidos pirimidínicos Glutamato Deshidrogenasa Degradación de aminoácidos Citrato sintasa, isocitrato y a-cetoglutarato deshidrogenasas Ciclo de Krebs

REGULACION POR MODIFICACION COVALENTE POR UNION COVALENTE DE GRUPOS (FOSFATOS , ADENILATOS, ETC.) INTERVIENEN ENZIMAS: QUINASAS, FOSFATASAS LA UNION DEL GRUPO PUEDE ACTIVAR O INHIBIR LA ENZIMA POR UN CAMBIO CONFORMACIONAL Fosforilacion Enzima Enzima Fosfoadenilacion ADP-Ribosilación

REGULACION POR MODIFICACION COVALENTE Fosforilasa fosfatasa 2 Pi 2 H2O Fosforilasa quinasa ATP ADP Fosforilasa b P -O-CH2 CH2- O- P Fosforilasa a (menos activa) (Cadena lateral de Ser) CH2- HO HO-CH2

REGULACION POR PROTEOLISIS Por eliminación de una cadena peptídica, enzimas inactivas se convierten en enzimas activas y viceversa. Las enzimas digestivas: pepsinógeno y quimotripsinógeno se convierten en las enzimas activas pepsina y tripsina. Suele ocurrir una activación secuencial produciéndose una cascada de activaciones. Ej. Coagulación sanguínea. ZIMÓGENOS

ISOENZIMAS Diferentes formas moleculares de una misma enzima. Son sintetizadas por genes diferentes Tienen diferente composición aminoacídica por lo que pueden separarse por electroforesis. Catalizan la misma reacción, actuando sobre el mismo sustrato para dar el mismo producto

REGULACION POR PROTEINAS Modifican la actividad de enzimas involucradas en el metabolismo celular. Por ej. Indirectamente activando o inhibiendo la actividad de la glutamina sintetasa. RNA polimerasa: Asn, Gln, Glu, Lys y Arg forman enlaces hidrógenos con las bases del DNA

Lactato deshidrogenasa (LDH) Presenta 5 isoenzimas con distinta composición en cuanto a sus subunidades y c/u es específica de un tejido. H4 H3M H2M2 HM3 M4 M > Músculo H > Corazón

Ejemplo de isoenzima: Glucoquinasa y hexoquinasa Actividad enzimática Km. hexq Km. glucq [glucosa mmol/l Cuando la concentración de glucosa en sangre es baja solo actúa la hexoquinasa. Cuando es elevada, por ejemplo luego de una comida, actúan ambas: hexoquinasa y glucoquinasa.

BIBLIOGRAFÍA   BLANCO, A., "Química Biológica", Ed. El Ateneo, 8° Edición, Bs.As, 2006. Reimpresión año 2007 CHAMPE, HARVEY, FERRIER, “Bioquímica”,Ed Mac Graw- Hill Interamericana, 3° Edición. 2006 LEHNINGER, A.L., NELSON, D., COX, M., "Principios de Bioquímica", Editorial Omega, S.A., 4° Ed., 2006. Reimpresión año 2008.