PRACTICAS EN BIOQUIMICA Cuantificación de Proteínas

METODOS COLORIMETRICOS BIURET LOWRY BRADFORD BCA Otros métodos: ABSORBANCIA (UV)

Cuantificación de Proteínas por Métodos Colorimétricos El uso de un determinado método colorimétrico depende de: Pureza de la muestra: presencia de otras proteínas, detergentes, agentes reductores Cantidad de proteína: límite de detección del método Disponibilidad de equipo, costo.

Método de Biuret Gornell AG, C. J. Bardawill, and M. M. DAVID Método de Biuret Gornell AG, C. J. Bardawill, and M. M. DAVID. Determination of serum proteins by means of the biuret. reaction. J. BioZ. Chem. 177: 751-766, 1949 Reacción de sales de Cu+2 con moléculas que contienen más de dos enlaces peptídicos en un medio alcalino; el Cu+2 es reducido a Cu+1 formando complejos color púrpura que tienen un máximo de absorción a 540 nm. El método se usa para soluciones que tienen de 0.5 a 10 mg proteína/ml o más. Es un método poco sensible. Es útil cuando se quiere analizar grandes lotes de proteína. Existen compuestos que interfieren con la lectura, tales como tioles y sales de amonio, que pueden removerse precipitando la proteína con un volumen igual de ácido tricloroacético al 10%, resuspendiendo el precipitado que contiene las proteínas en NaOH 1 N.

Método de Lowry Lowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J Método de Lowry Lowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951 Es un método más sensible que el de Biuret pudiendo detectar muy bajas concentraciones (hasta 5 ug). El principio de la detección es el mismo que el de Biuret. Diferencia: se utiliza un segundo reactivo: la solución de Folin– Ciocalteau (fosfomolíbdato-fosfotungstato) en un medio cúprico alcalino, el cual se le agrega para incrementar la intensidad del color. Este incremento en la intensidad se debe a la reducción del reactivo Folin– Ciocalteau por los residuos de tirosina y triptofano presentes en las proteínas. Producto coloreado leído en espectofotómetro a 750 nm.

Interferencias (Lowry) Most phenols, except nitrophenols, reduce the reagent; therefore thymol and to a lesser degree sulfosalicylic acid interfere, Glycine (0.5 per cent) decreases the color with protein by 50 per cent.

Método de Bradford Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248 El método de Bradford de basa en que el Azul Brillante de Coomasie G-250 cambia de rojo a azul, al unirse a residuos aromáticos y arginina en las proteínas. El complejo proteína-colorante tiene un coeficiente de extinción elevado, lo que le confiere gran sensibilidad. Cambio de 495nm a 595 nm.

Coomasie Brilliant Blue G-250 (utilizado en el método de Bradford)

Ventajas: Reacción rápida (aproximadamente 2-5 min) El completo proteína-colorante se mantiene por un tiempo relativamente largo (1 hora) Rango de detección: 1 -20 ug. Desventajas: Algunas interferencias : detergentes (Triton X-100 y SDS) Variación entre diferentes proteínas

Bicinchoninic acid (BCA) assay Similar al método de Lowry Formación del complejo Cu2+-proteina bajo condiciones alcalinas, seguida de la reducción de Cu2+ to Cu1+ (Cys, Trp, Tyr y enlaces peptídicos) BCA forma un complejo azul-púrpura con el Cu1+ (formado en medio alcalino) Lectura de absorbancia a 562 nm.

Ventajas del método BCA: Mas sensible que Lowry & Biuret No tiene tanta variación como el método de Bradford Color estable Menos susceptible a detergentes

Concentración de BSA Stock = 28 mg/ml. A. Método de Biuret: Concentración de BSA Stock = 28 mg/ml. 1.- Preparar 9 tubos según la tabla a continuación: Blanco Curva estándar M 1 M 2 1 2 3 4 5 6 Agua (ml) 100 90 80 60 40 20 50 Std (ml) 10 Muestra (ml)

2- Agregar 1,5 ml del reactivo de Biuret y mezclar por agitación. 3- Incubar por 10 minutos a 37ºC. 4- Leer en el espectrofotómetro a 540 nm. 5- Anotar los resultados y graficar.

Concentración de BSA Stock = 1 mg/ml. B. Método de Bradford: Concentración de BSA Stock = 1 mg/ml. 1.- Preparar 8 tubos eppendorf según la tabla a continuación: Blanco Curva estándar Muestra 1 2 3 4 5 6 Agua (ml) 1000 995 990 980 960 920 900 950 Std (ml) 10 20 40 80 100 Muestra (ml) 50

2- Colocar en un tubo de ensayo de vidrio 800 uL de cada mezcla. 3- Adicionar 200 uL del Reactivo de Bradford concentrado, mezclar por agitación. 4- Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos. 5- Leer en el espectrofotómetro a 595nm. 6- Anotar los resultados y graficar. 17

Concentración de BSA Stock = 1 mg/ml. C. Método de Lowry: Concentración de BSA Stock = 1 mg/ml. 1.- Preparar 9 tubos de ensayo según la tabla a continuación: Blanco Curva estándar M1 M2 1 2 3 4 5 6 Agua (ml) 168 158 148 128 88 48 8 68 Std (ml) 10 20 40 80 120 160 Muestra (ml) 100

3- Adicionar 1.65 ml del Reactivo 1 a cada uno de los 9 tubos. 2- Prepare 16.5 ml de Reactivo 1: Mezclar 50 volúmenes de Reactivo A (carbonato de sodio al 2%, NaOH 0.4%), mas 1 volumen de Reactivo B (sulfato de cobre pentahidratado al 0.5%, tartrato sodio potasio tetrahidratado 1%). 3- Adicionar 1.65 ml del Reactivo 1 a cada uno de los 9 tubos. 4- Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos. 5- Agregar 0.165 ml del Reactivo 2 (Fenol Folin-Ciocalteu). 6- Dejar reposar 10 min a temperatura ambiente. 7- Mezclar por agitación. Dejar reaccionar 30 minutos a temperatura ambiente. 8- Leer en el espectrofotómetro de 750 nm. 9- Anotar los resultados y graficar.

1. Lowry : Todos los grupos (30 min) 2. Biuret : Grupos 1,2,3 3. Bradford: Grupos 4,5,6

Absorción Ultravioleta de las Proteínas Todas las proteínas absorben fuertemente debajo de 230 nm. Por ejemplo, la albúmina sérica bovina (0.1% p/v) absorbe 5.0 y 11.7 a 225 y 215, respectivamente (comparado con 0.66 a 280 nm). La absorbancia por debajo de 230 nm es debido al enlace peptídico. Consecuentemente los valores de A 0.1% son casi los mismos para todas las proteínas. Concentraciones de proteínas en el rango de 10 a 100 ug/ml pueden determinarse de la diferencia de absorbancias a 215 y 225 nm. Se prepara una curva standard graficando A vs. proteínas. (proteína)ug/ml = 144 (Acm215 - Acm225) La diferencia de absorbancia es usada para minimizar errores que resulten de compuestos no proteicos en solución. Altas concentraciones de ciertos buffers pueden interferir (no se puede usar 0.1 N NaOH para disolver la proteína, pero 5 mM NaOH no causa problemas).