Micro ARN Proteína Nature 435: Science 277:

miARN.Transcripcion y modificaciones co-post-transcripcionales

miRNA:Mutados o Expresión alterada Mir-15.Mir16: LLC Mir :CC Let-7:Ca Lung.Pronostico Supresor de Tumores Proc.Natl.Acad.Sci.USA.101: Cell.120: ONCOGENES MICRO ARN (miARN)

Co-activador amplificado Ca.Mama Ca.Ovario Ca.Pancreas Ca.Estomago AIB1 CO-ACTIVADOR: ENHANCER RE; E2F1;FT,IGF

Objetivo del Trabajo EVALUAR EL ROL DE MIR-17-5p COMO POTENCIAL REPRESOR TRANSCRIPCIONAL DEL CO-ACTIVADOR AIB1 EN LA REGULACION DE PROLIFERACION CELULAR EN CANCER DE MAMA ESTUDIAR LOS EFECTOS DE MIR-17-5P/AIB1 EN CELULAS TUMORALES RE+/- IGF

Material y Métodos  CONSTRUCCION DE PLASMIDOS. VECTORES DE CLONADO Y EXPRESION PARA PROTEINA AIB1 Y MIR 17-5p  CULTIVOS CELULARES SOFT AGAR Y TRANSFECCIONES ESTABLES Y TRANSIENTES  PCR  NORTHERN BLOT  WESTERN BLOT

Vector De Clonado De MIR-17-5P

Expresión Proteína AIB1

VectorExpresiónProteínaAIB1

3 ´ UTR AIB1 MUTACION DIRIGIDA 3´UTR AIB1 NO MUTADAVectorClonado 3 ´ UTR AIB1

PROTEINA AIB1 + 3 ´ UTR AIB1 MUTADA (1) NO MUTADA (2) Construcción Proteína AIB1 3 ´ UTR

PGL3 3 ´ UTR PROTEINA AIB1 MUTACION 3 ´ UTR 3´UTR NO MUTADA PCDNA3.1 PROTEINA AIB1 PR+UTRm PR+UTR Resumen:Construcción Proteína AIB1-3 ´ UTR 1) 2)

AIB1 es blanco de MIR p –Analisis computacional Area codificante3` UTR 5`3`

pGL3 AIB 3`utr pGL3 AIBm 3`utr 2`O metil MIR-17-5p 2`O metil MIR-95 Celulas HELA

LUC-AIB 3`utrLUC-AIB m3`utr MIR 17MIR 95

Conclusion: el sitio complementario a mir 17 en AIB1 es blanco de silenciamiento postrascripcional de la expresion genica

La traduccion del AIB1 endogeno es suprimido por MIR p Mcf-7 2`O metil MIR-17-5p 2`O metil MIR-95 NORTHERN WESTERN

NORTHERN WESTERN

CELULAS HELA siRNA MIR 17

Mir-17-5p modula la señalización mediada por ER (1) Sabemos que… AIB1: Miembro de la familia SRC-1 Coactivador transcripcional Interactúa con el receptor de hormonas esteroides transcripción ligando dependiente ER: Factor de transcripción Interactúa con ERE Por lo tanto… AIB1 la actividad transcripcional de ER

¿Qué queremos evaluar…? La modulación que ejerce Mir-17-5p sobre la acción de los ER ¿Cómo lo hacemos…?

Linea Celular CHO-K1 ERE-Luc Mir-17-5p Mir-95 RE AIB1 +/- Estrógenos

Resultados…

Mir-17-5p 50% la actividad transcripcional ER dependiente en presencia de Estrógenos Mir-95 no tiene efecto sobre la actividad transcripcional ER dependiente

Mir-17-5p modula la señalización mediada por ER (2) Sabemos que… AIB1: Coactivador transcripcional y factor limitante ER: Factor de transcripción que interactúa con ERE AIB1: actividad transcripcional de ER Mir-17-5p: 50% la actividad transcripcional ER dep en presencia de Estrógenos

¿Qué queremos demostrar…? La modificación que ejerce Mir-17-5p sobre la acción ER dependiente, la hace a través de su target AIB1 ¿Cómo lo hacemos…?

Linea Celular CHO-K1 ERE-Luc Mir-17-5p Mir-95 RE AIB1 (wt3’UTR) AIB1 (m3’UTR) +/- Estrógenos

Resultados…

Cotransfección: AIB1 wt3’UTR + ERE-Luc + Mir-17-5p: transactivación mediada por ER Cotransfección: AIB1 m3’UTR + ERE-Luc + Mir-17-5p: Potente actividad transcripcional mediada por ER Tratamiento con Mir-95 no demostró diferencias significativas

Conclusión… La de proteína AIB1 mediada por Mir-17-5p, requiere de su sitio target AIB1 wt3’UTR mRNA indemne. Así efectivamente se bloquea la señalización mediada por ER.

Expresión de Mir-17-5p en líneas celulares de cáncer de mama y otros tumores (1) Sabemos que… Evento clave en CA Mama es el up-regulation de AIB1 por amplificación génica AIB1 es coactivador y factor limitante en el crecimiento de las células de CA Mama Mir-17-5p afecta la señal estrogénica, a través de AIB1

Hipótesis… La pérdida del control postranscripcional de Mir- 17-5p sobre AIB1 puede conducir a crecimiento celular disregulado en CA Mama ¿Cómo lo probamos…?

Northern Blot

Resultado … Expresión de Mir-17-5p ó es indetectable en líneas celulares de CA Mama comparadas con otras lineas celulares tumorales

Expresión de Mir-17-5p en líneas celulares de cáncer de mama y otros tumores (2) Hipótesis… Existe correlación entre expresión proteica celular de Mir-17-5p y AIB1

Western Blot

Resultado… AIB1 altamente expresado cuando Mir-17-5p tiene expresión

Conclusión… La down regulation de Mir-17-5p, puede ser factor importante en el crecimiento del CA Mama

La traducción del E2F1 endógeno es regulada por Mir-17-5p

Mir-17-5p reprime los genes de RE y E2F1

Mir-17-5p reprime la proliferación estrógeno- dependiente de células de cáncer de mama MCF7 transfección estable con vectores que sobreexpresan Mir-17-5p o Mir 95

W-B AIB1 marcada reducción en las células con expresión de Mir-17-5p Normal en células con expresión de Mir 95

MTT Tratamiento con 17β-estradiol Reintroducción de AIB1 con su 3´UTR mutado (escapa a la inhibición por Mir-17-5p)

Transfección transiente con 2´-O-metil Mir-17-5p o 2´-O-metil Mir 95 en células BT-474

En otra línea celular RE positiva que expresa Mir-17-5p(ZR75-1) se introdujo siRNA específico para Mir-17-5p

Ensayo MTT Método colorimétrico Bromuro de tetrazolio (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5- difenil-tetrazolio) AMARILLO Formazán AZUL-VIOLETA Se mide la absorvancia con espectrofotómetro Relación lineal con el número de células viables Mitocondrias de células viables

Mir-17-5p reprime la proliferación estrógeno- independiente de células de cáncer de mama Transfección transiente de células BT-20 (RE negativas) con 2´-O-metil Mir-17-5p o 2´-O-metil Mir 95 Reintroducción de AIB1 con su 3´UTR mutado (escapa a la inhibición por Mir-17-5p)

La deplecion de AIB1mediada por Mir-17-5p inhibe el crecimiento anclaje independiente de células MCF- 7 inducido por IGF-1

AIB1 juega un importante rol en el crecimiento de cél.MCF-7 mediado por IGF-1 y regulado por el FT E2F1. Dado que E2F1 es blanco de Mir-17-5p se utiliza un vector de expresión con Mir17-5p y E2F1 insensitivo Ej. con ausencia de su propio 3 ‘ UTRs.

1º chequean la expresión de E2F1 y AIB1 después de una transfección transiente de Mir-17-5p y un control: MIR 95.

El nivel de expresión de AIB1 y E2F1 se reduce por el tratamiento con Mir-17-5p y se recupera con el agregado de Mir -17-5p + formas insensitivas de AIB1 y E2F1.

2º )Evaluar efecto de Mir-17-5p sobre el crecimiento de células MCF-7 anclaje independientes inducidas por IGF-1

El IFG-1 induce el aumento del número de colonias mayores de 80 micrones de células MCF-7 control.

El aumento del número de colonias es eliminado por el agregado de Mir-17-5p y no se modifica con Mir-95

Se intenta rescatar la inhibición del crecimiento celular por Mir-17-5p usando formas insensitivas de AIB1 y E2F1 individualmente.

El rescate de crecimiento celular no es significativo : las colonias que crecen son menores a 80 micrones.

Por último se chequea la coexpresión de AIB1 y E2F-1 insensitivos observándose que aumenta significativamente el crecimiento de colonias anclaje independientes.

El efecto inhibitorio de Mir-17-5p sobre el crecimiento de células de cáncer de mama estrógenodependientesse debe a la regulación en la traducción tanto de AIB1 como de E2F1.

CONCLUSIONES A partir de diversas evidencias se ha implicado a los miARN en la génesis tumoral. Muchos genes de miARN se hallan localizados en regiones asociadas a amplificación,deleción y translocación en cáncer.

En este estudio se ha identificado al miARN Mir 17-5p como regulador genuino de la traducción del oncogen AIB1. AIB1 está sobreexpresado en células de cáncer de mama hormonodependiente e independiente. Es un coactivador de receptores nucleares ( RE ) y acelera la proliferación celular amplificando el efecto mitogénico.

La expresión de Mir-17-5p está disminuída en líneas celulares de cáncer de mama. Mir-17-5p inhibe además el camino mediado por E2F1. Mir -17-5p inhibe la proliferación celular independiente de anclaje.

El crecimiento hormono-independiente de células BT-20 también es inhibido por Mir-17-5p. AIB1 y E2F1 cooperan en la proliferación de cél. de cáncer de mama BT-20 RE (-) razón por la cual no se recupera la proliferación al máximo cuando no se introducen juntos.

El crecimiento celular mediado por IGF-1 dependen de la funcionalidad de AIB1 y E2F1. El locus c13orf25 parece ser que contiene una familia de 7 miARN incluyendo al Mir-17-5p. El locus c13orf25 está sobreexpresado en linfomas B.

La traducción del oncogen E2F1 es regulada negativamente por Mir-17-5p y se sugiere que actuaría como supresor tumoral en ca de mama. La región que contiene al policistrón Mir está delecionada en el 16,5% de ca de ovario, 21,9% de ca de mama y 20% de melanomas.

La desregulación de la función de Mir-17- 5p podría ser un mecanismo alternativo para controlar la proliferación celular en cáncer de mama. Mir-17-5p puede actuar como supresor tumoral o como oncogen dependiendo del ambiente celular en el que se exprese.

¡ Muchas Gracias!