Separación por Precipitación Globulinas: proteínas insolubles a bajas concentraciones de sales; albúminas, solubles Solubilidad depende del pH Distribución de residuos hidrofóbicos e hidrofílicos en la superficie de la proteína determina solubilidad Solvente siempre acuoso (no en membranas); puede manipularse para alterar solubilidad de las proteínas de interés: fuerza iónica, pH, solventes orgánicos miscibles, otros solutos + - Región hidrofóbica

Procesos de Fraccionamiento Para concentrar una proteína en particular a partir de una mezcla compleja No hay receta universal (ensayo y error) En cada paso, la proteína total se divide en una serie de fracciones; en cada una se busca la proteína de interés mediante ensayo específico Fraccionamiento exitoso: una fracción con alta actividad específica en donde se haya aumentado la pureza de la muestra Rendimiento: Unidades de enzima en la fracción Unidades de enzima en prep. Original Purificación: actividad específica de fracción actividad específica original

Fraccionamiento por Desnaturalización Diferente sensibilidad de las proteínas al calor Determinar a qué temperatura se desnaturaliza la proteína de interés (pérdida de actividad): Temp. crítica Remover a otras proteínas más termolábiles que la de interés Calentar muestra 5-10 ºC por debajo de Temp. Críticax 15-30 min. Centrifugar para remover la desnaturalizada (efecto del sustrato) Procedimiento semejante para efecto de pH

Fraccionamiento por Sales Sal más comúnmente usada: sulfato de amonio Altamente soluble en agua, muy pura, barata,no tiene efecto sobre la estructura de las proteínas Después de la adición de sal, proteínas precipitadas se centrifugan y se redisuelven en buffer Proteínas solubles pueden precipitarse con una concentración mayor de la misma sal Proteína precipitada es “salted out” Sal retira la capa de moléculas de agua que rodea a la superficie de la proteína. Grupos hidrofóbicos permiten que la proteína se agregue y precipite

Fraccionamiento con Solventes Orgánicos Diferente solubilidad de las proteínas en solución acuosa a solventes orgánicos: etanol, acetona, butanol Solvente: disminuye constante dieléctrica del medio  aumenta atracción entre moléculas cargadas y disminuye su interacción con el agua Solubilidad de la proteína disminuye: grupos hidrofóbicos son “protegidos” por solvente y grupos iónicos son dominantes Inverso a fraccionamiento con sales: grupos hidrofóbicos son expuestos Puede haber denaturalización y se pierde actividad

Fraccionamiento con Sales Proteínas están concentradas en la célula (40%) Concentraciones iónicas 0.15 – 0.2 M, pH neutro Cuando se extraen condiciones cambian. + repulsión + - atracción

log (solubilidad) = A – m(concentración de sal) parche hidrofóbico en proteína log (solubilidad) = A – m(concentración de sal) A = constante dependiente de temperatura y pH m = constante independiente de temperatura y pH

Para calcular cantidad de sulfato de amonio para 1 ml de solución a 20 ºC necesario para alcanzar la concentración deseada: g = 533 (S2 – S1) 100 – 0.3S1 S1 = concentración inicial de sulfato de amonio S2 = concentración final

Solubilidad de algunas proteínas puras a pH 7.0 (en mg/ml) [sulfato amonio] Proteína A m para solubilidad de 1 mg/ml (M) Aldolasa de músculo de conejo 6.30 2.84 2.20 Piruvato quinasa músculo conejo 10.2 4.34 2.34 GlyPi deshidrogenasa m.c. 8.6 2.84 3.34 Lactato deshidrogenasa m.c. 8.0 3.97 2.02 Fosfoglicerato mutasa m.c. 9.85 4.26 2.32 Albúmina sérica bovina 9.2 3.26 2.84

Fosforilasa Piruvato kinasa Aldolasa Lactato deshidrogenasa Enolasa Creatin quinasa Fosfoglicerato kinasa Mioquinasa Mioglobina parvalbúminas

Procesos de Fraccionamiento Actividad específica: Unidades totales de enzima en la fracción Cantidad total de proteína en fracción