Pedro Bosch Mendoza 13 Feb. 2014 Cromóforos catiónicos intercalantes de DNA: Fluorescencia y selectividad de secuencia Pedro Bosch Mendoza 13 Feb. 2014

Introducción RT-PCR Ensayos de fluorescencia Compuestos fluorescentes Quimioteca de compuestos catiónicos Ensayos de intercalación Intercalantes de ADN Ensayos de selectividad de secuencia Ensayos de fluorescencia Compuestos fluorescentes Bases estructurales de selectividad Sondas de ADN RT-PCR Tinción celular Ensayos de actividad antiproliferativa Potencial antitumoral

Introducción Quinolizinio Sistemas tri , tetra y pentacíclicos Variación de forma y tamaño

Síntesis Condensación de Westphal Westphal, O.; Jahn, K.; Heffe, W. Arch. Pharm. 1961, 294, 37-45. J. J. Vaquero, J. Alvarez-Builla, Adv. Nitrogen Heterocycles, 2000, 159-245 F. Delgado, L. Linares, R. Alajarín, J. Alvarez-Builla, J.J. Vaquero, Org. Lettt. 2006, 4057-4060

Síntesis Metátesis de cierre de anillo Grubbs 2º generación Hoveyda-Grubbs Núñez; B. Abarca; A. M. Cuadro; J. Alvarez-Builla; J. J. Vaquero. J. Org. Chem. 74, 4166 – 4176, 2009 A. Nuñez, A. M. Cuadro, J. Alvarez-Builla, J. J. Vaquero. Org. Lett. 2007, 9, 2977-2980 A. Núñez; A. M. Cuadro; J. Alvarez-Builla; J. J. Vaquero. Chem. Comm. 3, 2690 – 2692, 2006

Ensayo de selectividad Quimioteca de compuestos catiónicos Ensayos Intercalación / selectividad de secuencia de ADN Curvas de fusión Oligonucleótidos de secuencia definida Ligando unido: aumento de temperatura de fusión Intercalantes de ADN Ensayo de selectividad de secuencia ADN (preferencia AT vs GC) Ensayo de Intercalación con el ADN Selectividad vs estructura Quimioteca de compuestos catiónicos V. García-Hernández, Juan J. Vaquero, F. Gago, A. Domingo  A highly sensitive and miniaturized fluorescence-based DNA melting assay for DNA-binding ligand screening and profiling  Enviado A. Domingo, V. García-Hérnandez, J. J. Vaquero, PCT/ES 210000264, 2010  

Ensayos Intercalación / selectividad de secuencia de ADN Curvas de fusión Oligonucleótidos de secuencia definida Ligando unido: aumento de temperatura de fusión V. García-Hernández, Juan J. Vaquero, F. Gago, A. Domingo  A highly sensitive and miniaturized fluorescence-based DNA melting assay for DNA-binding ligand screening and profiling  Enviado A. Domingo, V. García-Hérnandez, J. J. Vaquero, PCT/ES 210000264, 2010  

Ensayos Intercalación / selectividad de secuencia de ADN Unión ADN Selectividad GC ó AT 1 No --- 2 Sí AT 3 Muy débil No existe 4 5 6 Unión ADN Selectividad GC ó AT 7 No --- 8 9 Débil AT 10 11 Muy débil 12 Sí

Ensayos Fluorescencia: Máx. emisión Eficiencia cuántica 1 442 0,33 2 544 < 0,05 3 464 4 461 0,14 5 361 0,23 6 467 0,15 Máx. emisión Eficiencia cuántica 7 353 0,18 8 437 < 0,05 9 419 0,15 10 400 0,35 11 398 0,31 12 450 0,25

Ensayos 6 12 1

Valoración Fluorescencia Materiales Cromóforos (5% DMSO, 3,9·10-5M) DNA Timo bovino (10 µl, 4,1·10-3M) Procedimiento Adición de alicuotas de DNA sobre disolución de cromóforo Tiempo de intercalación: 10 min Error correspondiente a dilución menor del 5% Ratio 1:12 cromóforo/DNA

Valoración Fluorescencia Gráficas 12 1

Valoración Fluorescencia 12 Gráficas Área bajo la curva Anisotropía de fluorescencia Constante de unión al DNA Kb= (6.92.6) 104 M-1 Pares de bases por cromóforo (n): 5.90.3 1

Dicroísmo circular inducido Luz polarizada en un plano Plano formado por 2 componentes en fase Dicroísmo circular inducido: Transferencia de asimetría Cercanía en el espacio Molécula capaz absorber

Dicroísmo circular inducido Gráficas Señal correspondiente al apilamiento de bases y a helicidad. CD aumenta en presencia de cromóforo Este cambio sugiere intercalación

Dicroísmo circular inducido Gráficas

Nuevos cromóforos Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998 Dyes and pigments 96 (2013) 554-562

Nuevos cromóforos Dyes and pigments 96 (2013) 554-562

Nuevos cromóforos Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998

Nuevos cromóforos Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998

Nuevos cromóforos Perspectivas Cromóforos funcionalizados Compuestos con un aumento de fluorescencia al estar unidos al DNA

Síntesis del Híbrido Losartán-inhibidor de RAS

Híbrido de Losartán Introducción Objetivo Losartán Inhibidor de RAS Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona ARAII Inhibidor de RAS Proteína reguladora Proteína G monomérica Activación y proliferación Objetivo Estrategia

Híbrido de Losartán Síntesis del inhibidor de RAS J. Med. Chem. 2010, 53, 6838–6850

Híbrido de Losartán Oxidación de Losartán A. Avenoza et al. Tetrahedron: Asymmetry 12 (2001) 949-957

Híbrido de Losartán Síntesis del Híbrido Tesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008

Híbrido de Losartán Desprotección del Híbrido Tesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008

Híbrido de Losartán Perspectivas Desprotección del grupo tritilo utilizando Pt/C 5% Se evita la deshalogenación. Tesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008