Parte III. Monitoreo del proceso de purificación. A. Determinación de la concentración de proteínas
Objetivos 1. Conocer los métodos que se utilizan para monitorear el proceso de purificación de una proteína. 2. Adquirir la habilidad para analizar el progreso de la purificación de una proteína. 3. Aplicar un método espectrofotométrico para medir la concentración de una proteína. 4. Determinar la concentración mediante la detección de la absorbancia a 280nm. 5. Determinar la concentración de una proteína utilizando un método colorimétrico: Determinación de proteínas por Bradford. 6. Analizar el progreso de la purificación de una proteína. 7. Conocer algunos parámetros que se determinan durante la purificación de una proteína: rendimiento y pureza. 8. Aplicar el conocimiento adquirido para elaborar esquemas de purificación de proteínas.
Cómo monitorear un proceso de purificación? Para evaluar de manera cuantitativa el éxito de una purificación de proteínas es necesario conocer dos parámetros: a) el rendimiento y b) el grado de pureza de cada paso del proceso de purificación.
El rendimiento Parámetro expresado en porcentaje que se obtiene de medir la actividad biológica de la proteína de interés en cada paso de la purificación. El 100% corresponde a la actividad del extracto inicial.
Tabla de purificación
Grado de pureza Se refiere al incremento en pureza, valor que se obtiene de dividir la actividad específica de cada paso entre la actividad específica del paso inicial de purificación, este índice da el valor de 1 para el extracto inicial. La actividad específica se expresa en Unidades/ mg proteína -1
Tabla de purificación
Ejemplo de tabla de purificación
¿Qué necesitamos hacer para construir nuestra tabla de purificación de la LDH? a) una técnica que determine la concentración de proteínas en la muestra, y b) una técnica que específicamente detecte o mida la cantidad de la proteína blanco (Unidades de actividad).