Curvas temporales de actividad enzimática

Presentación del tema: "Curvas temporales de actividad enzimática"— Transcripción de la presentación:

1 Curvas temporales de actividad enzimática
Discusión

2 Objetivos Conocer las características generales de las enzimas como catalizadores biológicos. Adquirir la habilidad para medir la actividad de una enzima utilizando un método espectrofotométrico. Relacionar los distintos parámetros asociados a la medición de la actividad enzimática que permiten seguir y evaluar la purificación de una enzima (actividad específica, rendimiento y enriquecimiento).

3 Lactato deshidrogenasa

4

5 Datos obtenidos de la actividad de los extractos de las fracciones obtenidas de la purificación de la LDH de músculo de bovino TIEMPO FRACCION 3 FRACCION 4 fpii Fpii2 FPA dil 1:20 conc 0.5 1.027 1.047 1.257 1.263 1.107 1 0.919 0.922 1.109 1.5 0.8 0.798 1.253 1.261 1.105 2 0.697 0.68 1.106 2.5 0.59 0.567 1.241 1.008 3 0.487 0.461 1.007 3.5 0.392 0.364 1.237 1.26 4 0.307 0.276 1.240 4.5 0.23 0.202 1.259 5 0.166 0.141 1.005 Después se grafican los datos para obtener las pendientes de las curvas

6

7 Cálculos mg proteína F3= mg (lo obtuve al considerar que había 7.25 /L en el concentrado (datos de determinación de proteína de mi extracto) al diluir 1:20 quedaron g/L, como añadí 50 L entonces la celda tenía mg)

8 ACTIVIDAD DE LDH DE LAS FRACCIONES 3 Y 4 DEL PROCESO DE PURIFICACIÓN DE AL ENZIMA
Fracción 3 (mol min-1mg-1) Fracción 4 m 0.1946 0.2043 r2 0.99 Actividad

9 ¿Cómo calcular el factor de purificación o las veces de purificación?
Cuando se purifica a una proteína es habitual usar una tabla con datos que nos indiquen si el proceso que se llevo a cabo fue efectivo. Cuando una proteína no pierde actividad biológica esta se sigue a través de medir esa actividad. Etapa Volumen (ml) Actividad Total (U) Proteína Total (mg) Act. Espec. (U/mg) Cantidad (%) Factor de Purificación EC 500 3,000 15,000 0,2 100 SA 2,400 4,000 0,6 80 3,0 CII 45 1,440 2,9 48 14,5 FG 50 1,000 125 8.0 33 40,0 EC: Extracto crudo. SA: Precipitación con sulfato de amonio. CII: Cromatografía de intercambio iónico. FG: Filtración en gel.

10 Fase 1 Homogeneizado del músculo esquelético de ternera.
Diagrama de flujo generalizado de la purificación de la Lactato Deshidrogenasa. Fase 1 Homogeneizado del músculo esquelético de ternera. Fase 2 Precipitación por salado, remoción de proteínas no requeridas. Fase 3 Obtención de proteína purificada, por cromatografía de exclusión molecular seguida de la cromatografía de afinidad.

11 Volumen total de la fracción [µL] Proteína total en la fracción [µg]
Tabla de purificación de la LDH de músculo esqueleto de bovino (equipo 6) Fracción Proteína [µg /µL] Volumen total de la fracción [µL] Proteína total en la fracción [µg] Rendimiento 1 13.72 30000 411600 100% 2 14.13 29000 282600 68.66% 3 15.55 2500 38875 9.44% 4 15.93 1000 15930 3.88% FPA 1.474 900 1326.6 0.32% FPB 1.364 1227.6 0.29%

12 Purificación de la LDH